Рисунки по клеточкам в тетради фрукты: Рисунки по клеточкам в тетради

Интересные рисунки по клеткам. Идеи украшения тетрадей в клеточку

Вам нравится Япония? Вы любите разгадывать кроссворды?Должно быть, Вы думаете: «К чему все эти вопросы? Так вот! Японцы обожают разгадывать кроссворды, и в основе их лежит рисование по клеточкам. Если правильно разгадать кроссворд, то получаются очень интересные рисунки.

Освоить процесс рисования по клеточкам сможет почти каждый. Для этого вам не нужно оканчивать художественную школу или иметь особый талант рисования. Просто будьте креативным! Приступим!

Для лёгкого и быстрого обучения приобретите тетрадь в клеточку, простой карандаш и фломастеры.Просто наглядным способом перенесите рисунки в тетрадь.

Если Вы новичок – используйте готовые схемы, а когда научитесь этому процессу – придумывайте свои идеи!

Шаблоны

Лицо человека

Что может быть прекраснее, чем лицо человека? Создайте портрет своими руками и наслаждайтесь Вашим творением!

Фрукты

Такие сладкие и полезные! Когда мы смотрим на них, у нас поднимается настроение, и наш организм хочет получить свою долю витаминов.

Сердце

Самый популярный рисунок – наш «мотор жизни», который ассоциируется с прекрасным чувством любви.

Другие идеи

Вы можете рисовать по клеточкам домашних питомцев, машины, сладости, дома, город, цветы, флаги разных государств, буквы и многое другое…

Реализуй творческие способности! Рисунки в формате 3D!Это прекрасный способ интересного досуга. Учёными доказано, что во время рисования нервная система человека успокаивается, развивается мышление, улучшается память и сосредоточенность.

Создавайте яркие и насыщенные рисунки, добавляйте краски в свою жизнь! Таким интересным рисунком можно украсить интерьер, создать аппликацию или порадовать друга своим подарком!

Не каждому удалось окончить художественную школу, чтобы научиться технике рисования. Если хотите сделать креативную открытку или заполнить дневник оригинальными рисунками, освойте рисование по клеточкам. Маленькие картинки по клеточкам смогут сделать даже новички. Главное, купить тетрадку для математики со светлой бумагой.

Как рисовать по клеточкам

Многие любят разгадывать японские кроссворды, в основу которых положено рисование по клеточкам. Если у вас есть готовые разгаданные кроссворды или ответы к ним, то сможете просто перерисовать в свою тетрадку большие фигуры.

Самый хороший способ использовать готовые схемы, которые были специально разработаны для тех, кто не умеет рисовать. Вы можете закрашивать по схеме клеточки в собственной тетради, а потом удивлять красивыми изображениями близких и родных.

Среди шаблонов вы найдете

Оригинально смотрятся фрукты по клеточкам . Если хорошо закрасить рисунок яркими фломастерами, то потом можно его вырезать и использовать для декора интерьера или украшения аппликации.

Хотите сделать открытку или описать в своем дневнике романтическую историю, тогда нарисуйте сердечко по клеткам.

Конфетки, букетики, цветочки – все это можно нарисовать по клеточкам.

Если вы освоите принцип, то потом сможете изображать все, что угодно в своей собственной тетради.

Хотите придумать свой собственный рисунок? Тогда сделайте легкую зарисовку, а потом начинайте превращать ее в рисунок по клеточкам. Начинать лучше всего с контура. Потом можете выделять мелкие детали. Не забудьте отметить, каким цветом, какая деталь должна быть выделена, чтобы рисунок получится ярким и красивым.

3D-рисунки по клеточкам – это хороший способ провести интересно досуг и реализовать свои творческие способности.

Вы еще ни разу не рисовали по клеточкам? Тогда обязательно попробуйте. Это занятие придется по душе как маленьким детям, так и взрослым. Специалисты отметили, что это хобби развивает творческое мышление, координацию движений при письме, концентрацию внимания и логику. Проводите досуг с пользой, выдумывая новые 3Д схемы простые и сложные для рисования по клеточкам.

Сложный рисунок по клеточкам

Предлагаем фото нескольких популярных схем для начинающих

4.7 (93.8%) 158 votes

Рисунки по клеточкам или пиксель арт очень популярный вид искусства у школьников и студентов. На нудных лекциях рисунки по клеточкам спасают от скуки.Прототипом рисования по клеткам послужило вышивание крестиком, где на канве, ткани размеченной клеточками, наносили рисунок крестиком. Все мы были когда-то студентами и школьниками и рисовали от скуки разные картинки в клеточках, каково же было мое удивление, когда я узнал, что это практически искусство со своими шедеврами и гениями. Я стал изучать вопрос подробнее и вот что из этого вышло…

На чем рисовать рисунки по клеточкам

Это искусство доступно любому, главное следовать четко по клеточкам. Для нанесения изображения идеально подходят школьные тетради, размер их квадратиков 5х5 мм, а самой тетради 205 мм на 165 мм. На данный момент у художников по клеточкам набирают популярность пружинные тетради-блокноты с листом формата А4, размер этого блокнота 280мм на 205мм.

Профессиональные художники творят свои шедевры на миллиметровках (чертежной бумаге), вот уж где места разгуляться. Единственный минус миллиметровой бумаги её бледно зеленый цвет, который не заметен, когда вы зарисовываете цветными ручками.
Выбрав тетрадь для рисования, обратите внимание на плотность бумаги, от её плотности зависит качество вашего рисунка по клеточкам, будет ли он проступать на изнаночную сторону листа. Идеальная плотность листа не меньше 50г/метр.кв.

Чем рисовать рисунки по клеточкам

Для раскрашивания рисунков по клеточкам не нужны никакие специальные инструменты, подойдут любые карандаши и ручки. Монохромные картины это очень здорово, но так хочется добавить в жизни красок. Для того, чтоб краски стали разнообразными, зайдите в канцелярский магазин и выбирайте все что душе угодно, гелевые ручки, масляные, шариковые.

Шариковые ручки для пиксель арт

Фломастеры для рисунков по клеточкам

Если же вы любите рисовать фломастерами, ваше право, расцветка фломастеров очень богата. Стоит помнить, что фломастеры делятся на две группы: спиртовые и водные, водные безопасней, но они могут размочить бумагу. Спиртовые также могут размачивать бумагу, еще и запах сильно на любителя.

Карандаши для рисунков по клеточкам

Карандаши, еще один из видов зарисовывающих приспособлений. Карандаши не исключение в разнообразии видов, они бывают пластиковыми, восковыми, деревянными и акварельными. Деревянными мы рисуем с раннего детства, и знаем, что они часто ломают грифель. Пластиковые и восковые ломаются реже, но они более толстые, что будет менее удобно в рисовании. Об акварельных карандашах не может быть и речи, так как после закрашивания карандашом нужно покрывать рисунок увлажненной кисточкой, а это недопустимо для тетрадных листов.

Посмотрите видео о том, как просто рисовать рисунки по клеточкам и как красиво может быть в результате:

Еще несколько схем рисунков, которые мне понравились:

Точечная графика — технология пиксель арт

В том, какие нужны принадлежности, мы разобрались, теперь познакомимся с технологией. Технология пиксель арта очень проста, это точечная графика.

Перед тем, как приступить к рассмотрению способов пиксель арта, вернемся в детство 80х -90х годов. Конечно, те, кто рос в постсоветское время, помнит 8-ми битные видеоигры, игровая графика, которых, построена на пиксельной графике.

Лучший способ освоить, что-либо это практика, давайте попробуем освоить пиксель арт:

Возьмем черную и красную масляную ручку, и тетрадный лист в клеточку.

Для начала сделаем простенький рисунок. Посчитаем клетки, определим контур и разукрасим согласно цветам.

К примеру, нарисуем сердечко:

1. Берем листик в клетку и ручку с черной пастой, ставим 3 точки, как на рисунке, точки помечают, какие клетки будут закрашены черным.

2. Рисуем линии, обозначающие контуры рисунка.

3. Отметим по три точки с каждой стороны, смотри рисунок.

4. Двумя линиями отметим область рисунка.

5. Поставим еще по одной точке с каждой стороны и пролинеем границы под верхними точками.

6. По вертикали нарисуем 8 точек и по 4 точки с обеих сторон, так как изображено на рисунке ниже.
   
7. Проведя вертикальные линии, так как показано на рисунке, мы полностью укажем границы рисунка.
   
8. Таким же образом отметим нижнюю часть сердца слева и справа.

9. Обводим клетки, так как на нашем изображении.

10. Следующее, что мы должны сделать, это закрасить красной ручкой внутреннюю часть сердца, оставив блик света не закрашенным.

11. И последнее, черной ручкой заштрихуем клетки, помеченные точками. Теперь вы научились рисовать восьмибитные картинки.

Если вам кажется, что большие и объемные картинки не для вас, стоит попробовать нарисовать фотографию из интернета. Испугались? Не стоит.

Возьмите

• черную ручку,
• карандаши,
• тетрадь в клеточку,
• компьютер,
• фотографию или картинку из интернета
• программу фотошоп.

Для нанесения объемных рисунков нам нужно посчитать количество клеток, которые будут закрашены. Довольно трудно не ошибиться на больших количествах. Еще обязательно подберите оттенки цветов схожие с исходным изображением.
Итак, действуем:

Дам один совет, который очень мне помогает, если у вас есть цветной принтер, распечатайте рисунок, если нет, не страшно. Прочертите сетку по 10 клеток более жирным контуром. На напечатанном листе с помощью линейки и контрастной ручки, если распечатать негде, то можно открыть изображение в Paint.
Творческих вам успехов.

Всегда найдутся маленькие сластёны, которые обожают придумывать необычные виды десертов. Развивайте этот талант в ребёнке, помогая освоить рисунки по клеточкам…

Кошечки, собачки, медведи и другие пушистые представители животного мира так и просятся стать сюжетом детского рисунка. Чтобы научиться реалистично изображать л…

Для поднятия настроения друзьям и близким, создания красивой поздравительной открытки существуют рисунки по клеточкам смайлики. Научиться этому искусству сможет…

Нравится придумывать новые блюда, необычно украшенные торты, экзотические фрукты и другие вкусности? Всё, что готова создать ваша фантазия, легко уместиться на…

Не отставайте от своих сверстников, скорее учитесь рисовать картинки по клеточкам Майнкрафт. Придумайте свою художественную историю этой увлекательной игры. Воз…

Чтобы не было скучно на переменках или в поездке, научитесь рисовать по клеточкам Майнкрафт. Изображение главных героев, локаций, домов и других объектов на бум…

Всем маленьким поклонникам компьютерных игр наверняка интересно как нарисовать по клеточкам Майнкрафт. Не всегда есть возможность воспользоваться планшетом для…

Видели, как увлечённо ваши одноклассники создают рисунки по клеточкам Майнкрафт? Немного усидчивости, фантазии и на бумаге появляется новый герой игры, заполнен…

Играть в развивающие компьютерные игры, такие как Майкрафт – это очень интересно. Дети могут часами просиживать в ней. Никто не откажется от возможности поискат…

Картинки для срисовки: фрукты (39 милейших картинок)

Фруктовый праздник ждет тебя сегодня!) А еще ты научишься оживлять их и делать прикольные картинки.

Хэй, банана мама)

Рисуем ананаса))))

 

Смотри и я умею)

Сбоник моих любимых мням мняшек). А какой у тебя любимый фрукт?

Ктуто, да?

Есть краски? Одолжи, тоже хочу так попробывать

 

Наброски карандашом — я набросал конечно

ААААААААААААААААНАНАС

 

Снова моя работа, учись)

А еще говорят женщины слабые…ты посмотри на нее…во дает!

Пошаговая инструкция — подготовил мой товарищ

Я бл око, не отвлекайся — рисуй скорей

 

Чем сидеть в интернете, лучше заведи себе альбом

Эхоу, хай!

Сочный апельсин

Я начал — ты продолжи

Умеешь кататься на скейте, как этот смелый арбуз?

Яблочки…ммм

Ах, какая потрясающая работа

Лайм на самом деле рисуется легко

Пока ты учишься — я уже стал бананабабушкой

Коллекция моих работ — вот что я скопил к старости)

Маркетинг фруктов и овощей для мелких и частично занятых производителей

Некоторые фермеры, такие как фермеры, выращивающие товарное зерно или молочные фермы, имеют большие, устоявшиеся рынки. Они могут использовать существующие организации для выполнения за них маркетинговой функции, или они могут объединиться, создать кооператив и совместно продавать свою продукцию. Мелким производителям фруктов и овощей обычно труднее найти устоявшиеся рынки сбыта; поэтому они обычно разрабатывают маркетинговые системы с учетом своих уникальных ситуаций.

Основные рынки

Фрукты и овощи производятся сезонно, но рынок нуждается в продуктах круглый год. В течение многих десятилетий эта проблема соответствия доступности продукции потребительскому спросу решалась двумя способами:

• Продажа свежих продуктов во время сбора урожая и вскоре после него
• Переработка остатков для удовлетворения спроса в течение оставшейся части года

По мере совершенствования технологий и увеличились доходы потребителей, появилась возможность обеспечивать свежими продуктами круглый год.Американские потребители теперь ожидают свежих помидоров, клубники и сладкой кукурузы каждый месяц в году. Кроме того, сохраняется высокий спрос на переработанные фрукты и овощи.

Свежие рынки

Увеличение доходов потребителей и круглогодичный спрос на свежие продукты вынуждают розничных продавцов или их представителей открывать точки закупки как в различных сельскохозяйственных районах США, так и в других странах. Некоторые розничные торговцы заключают круглогодичные контракты с упаковщиками свежих фруктов и овощей, которые, в свою очередь, могут заключать контракты с производителями.Контракты и практика закупок в больших объемах позволяют упаковщикам получать достаточное количество отдельных продуктов.

Крупные упаковщики свежих фруктов и овощей могут заключать контракты с производителями в нескольких различных производственных регионах, чтобы гарантировать наличие свежих фруктов и овощей каждую неделю в году. Эти упаковщики обычно заключают контракты только в регионах с большим количеством производителей. Кроме того, они заключают контракты в основном с крупнейшими производителями, даже в регионах с высокой концентрацией производства. Некоторые упаковщики обеспечивают поставки, выращивая сырье самостоятельно.Крупные розничные торговцы и упаковщики вряд ли будут закупать продукцию напрямую у одного мелкого производителя, особенно у производителя в удаленной производственной зоне.

Как небольшой производитель свежих фруктов и овощей, вы можете рассмотреть возможность продажи напрямую розничным торговцам. Хотя некоторые сетевые магазины и независимые розничные продавцы имеют программы покупки свежих продуктов у местных жителей, такие магазины и программы встречаются нечасто. Вы должны разработать собственную маркетинговую систему. По сути, вы должны стать производителем, упаковщиком и оптовым продавцом.

Рынки переработки

Чтобы оставаться конкурентоспособными, переработчики должны поддерживать низкую себестоимость единицы продукции, поэтому переработкой обычно занимаются крупные корпорации. Многим мелким местным переработчикам было трудно конкурировать с этими корпорациями, и они прекратили свою деятельность. Почти все переработчики заключают контракты с производителями для удовлетворения своих потребностей в сырье. За последние двадцать-тридцать лет большинство переработчиков перенесли свои заводы в крупные производственные районы. На Северо-Востоке осталось всего несколько перерабатывающих фирм.Поэтому может быть сложно найти переработчиков, заинтересованных в покупке у мелких производителей. Если переработчик выражает готовность купить, настаивайте на заключении договора купли-продажи с переработчиком, прежде чем сажать урожай.

Вы можете сами перерабатывать фрукты и овощи. Именно так многие современные процессоры вошли в бизнес несколько десятилетий назад. Если вы планируете операцию по переработке, свяжитесь с Департаментом сельского хозяйства вашего штата, чтобы узнать больше о пищевых правилах, касающихся обработки, упаковки и маркировки вашего продукта.Вероятно, вы не сможете перерабатывать и продавать продукцию по таким низким ценам, как у более крупных переработчиков. В результате может быть очень сложно конкурировать за продажи переработанных фруктов и овощей через обычные торговые точки. Рассмотрите возможность обработки специализированных товаров с высоким местным или региональным спросом, где вы сможете взимать «премиальную» цену.

Иногда небольшой переработчик будет перерабатывать фрукты или овощи для производителя на контрактной основе, особенно если производимый продукт не мешает его собственным требованиям к переработке.Конечно, его занятое время часто приходится на время, когда вам нужно обработать свой продукт, поэтому это лучше всего подходит для чего-то с особенно ранним или поздним сезоном обработки.

Продажа переработанных фруктов или овощей может, кроме того, увеличить вашу подверженность искам об ответственности за качество продукции. Проконсультируйтесь с адвокатом и страховой компанией, чтобы определить степень подверженности ответственности и обеспечить надлежащий уровень защиты.

Оценка рыночного спроса

Крупные производители, особенно расположенные в крупных производственных районах, могут использовать любой из двух традиционных вариантов маркетинга: оптовый маркетинг свежих продуктов или переработка.Мелким производителям, которые считают, что эти маркетинговые возможности закрыты для них, необходимо будет использовать подход, ориентированный на потребителя. Это требует тщательного изучения рынка и поведения клиентов, прежде чем планировать производство сельскохозяйственных культур.

Некоторые фермеры получают прибыль, сначала сажая, а затем ища рынок сбыта, но это чрезвычайно рискованно для производителей фруктов и овощей. В этой ситуации гораздо больше неудач, чем историй успеха. Если вы новичок или опытный производитель, планирующий производить новый продукт, вы должны сначала попытаться оценить рыночный спрос на продукт, а затем решить, какие каналы прямого маркетинга лучше всего удовлетворят потребности ваших потребителей.Ваши оценки прибыльности должны включать затраты на каналы сбыта, а также производственные затраты.

Мелкие производители должны собрать три типа информации, прежде чем принимать решение о производстве и продаже свежих фруктов и овощей.

• Определите географическую область, в которой вы будете продавать свежие фрукты и овощи. Определите потенциальных клиентов, прежде чем исследовать потребительский спрос.
• Оценка уровня неудовлетворенного спроса среди потребителей в пределах определенной области сбыта.Целесообразно оценить количество, которое потребители (покупатели) на этом рынке покупают в настоящее время. В процессе вы получите представление о том, как их можно лучше обслуживать.
• Рассмотрите конкурентную структуру вашего рынка. Знание того, кто ваши потенциальные конкуренты, где они расположены и какие услуги они предоставляют, является важной информацией для вас как начинающего производителя-маркетолога. Обратите внимание на потенциальных конкурентов, которые могут иметь маркетинговые преимущества (более низкие затраты, лучшее расположение и более качественная продукция) или могут предоставить потенциальным потребителям аналогичные продукты.

Вы должны узнать как можно больше о потребителях, которые могут купить ваш продукт(ы). Какие продукты покупают ваши потенциальные потребители, где они покупают и когда эти продукты доступны? Посещение других районов вашего штата или США может помочь вам лучше понять поведение потребителей и методы маркетинга продукции. Персонал по развитию является ценным источником информации о ситуации с местным маркетингом. Кроме того, офисы расширения часто проводят учебные семинары и семинары специально для специалистов по прямому маркетингу.Данные о демографии клиентов собираются Бюро переписи населения США. Эту информацию можно найти в Интернете по адресу census.gov.

Определите вероятное влияние увеличения производства на будущие цены реализации. Если вы размещаете на рынке больше продукции, и продукты не отличаются качеством или не удовлетворяют какой-либо другой «неудовлетворенной потребности», за которую потребители готовы платить более высокую цену, то вполне вероятно, что цены упадут по сравнению с текущим уровнем. Ожидаемая цена является важной частью информации для целей планирования.Не существует простого и надежного способа прогнозирования цен на местном рынке, но такая информация очень важна для производителей. Оцените цены, рассмотрев всю доступную информацию и руководствуясь здравым смыслом. При использовании этих ориентировочных цен для планирования не забудьте включить расходы на маркетинг и стоимость непроданной продукции.

Представлять новый продукт потребителям и убеждать их купить его сложно, потому что большинство из них не знакомы с ним или его возможными вариантами использования. Процесс обучения требует времени.Новый товар может дать вам точку опоры на рынке, который будет быстро расти. Однако более вероятно, что он будет расти медленно, что может привести к потерям продукции в течение первых нескольких лет. Если фрукты или овощи потребляются повсеместно, вы должны выяснить, увеличатся ли покупатели, когда они будут выращиваться и продаваться выбранным вами способом.

Супермаркеты являются основными поставщиками свежих фруктов и овощей, но, как правило, не являются сильными конкурентами при продаже сезонных культур. Например, супермаркеты продают очень мало сладкой кукурузы, когда она доступна на фермерских рынках или вдоль дорог.Другие прямые маркетологи, будь то самовывоз, придорожные рынки, фермерские рынки или бордюрные рынки, являются вашими основными конкурентами. Имейте в виду, что вход и выход из рынка может происходить очень быстро. В последние годы специалисты по прямому маркетингу выразили обеспокоенность по поводу увеличения числа конкурентов и возможности потери прибыли в существующих операциях.

Вот несколько важных вопросов, на которые вы, как производитель-маркетолог, должны ответить:

• Кто является вероятным потребителем вашей продукции и где эти потребители живут?
• Сколько людей проживает в вашей маркетинговой зоне?
• Покупают ли потребители в настоящее время определенные фрукты или овощи?
• Какое количество продуктов в настоящее время используют ваши потенциальные клиенты? Является ли это использование сезонным?
• Какие цены платят потребители за высококачественную продукцию?
• Адекватно ли обслуживаются потребители в настоящее время?

Если потребители в этом районе обслуживаются должным образом, вот несколько дополнительных вопросов:

• Можете ли вы сделать работу лучше и оторвать часть рынка от конкурентов?
• Можно ли увеличить количество, которое покупают потребители, путем обеспечения более высокого качества, чем сейчас?
• Будет ли ожидаемая вами продукция поступать в то время, когда мало что еще предлагается для продажи?
• Какой уровень качества вы должны производить, чтобы удовлетворить неудовлетворенные потребности потребителей?
• Как подготовить и упаковать продукты? Контейнеры какого размера наиболее популярны? Какие расходы на маркетинг будут понесены?

Выбор канала прямого маркетинга

При выборе канала прямого маркетинга необходимо учитывать несколько факторов.Расположение может иметь большое влияние на прибыльность предприятия, поскольку оно влияет на используемый канал прямого маркетинга, а также на способность привлекать клиентов. Кроме того, некоторые каналы прямого маркетинга, такие как самовывоз, хорошо работают для одних продуктов, но не так хорошо для других.

Доставка фруктов и овощей на рынок требует особого обращения. Чтобы сохранить качество и товарность, каждый урожай необходимо собрать, подготовить к продаже, упаковать и отправить.

Любой прямой маркетинг продукции может увеличить вашу подверженность риску. Страховой полис владельца вашей фермы может предусматривать страхование ограниченной ответственности за продукцию; однако следует рассмотреть возможность дополнительного покрытия. Проконсультируйтесь со своим страховым агентом, чтобы определить уровень риска. Дополнительную информацию о страховании сельскохозяйственного бизнеса можно найти по номеру Страхование сельскохозяйственного бизнеса .

Мелкие производители используют четыре различных канала прямого маркетинга. Эти каналы различаются по количеству труда и капитала, которые должен предоставить маркетолог, а также по расположению рынка.

• Придорожный маркетинг на сегодняшний день является наиболее распространенной системой прямого маркетинга. Система требует некоторых капиталовложений в объект, и вы должны обеспечить сбор урожая, подготовку рынка и розничную торговлю. Отношения с клиентами чрезвычайно важны, но они более традиционны, чем отношения между клерком и покупателем. Местоположение очень важно для придорожного маркетинга. Дополнительную информацию о создании и управлении успешным придорожным рынком можно найти в документе «Развитие придорожного рынка» .
• Фермерские рынки или «рынки у тротуаров» аналогичны придорожным рынкам, но функция розничной торговли просто перенесена ближе к потребителю. Это позволяет компенсировать недостатки вашего производства. Одним из преимуществ является создание высокого уровня трафика клиентов. Потребности в персонале легко планировать, поскольку операции обычно выполняются только в определенные часы. Однако одним большим недостатком является необходимость прогнозировать продажи, чтобы можно было собрать и подготовить достаточное количество продукции каждый базарный день.На фермерском рынке вы, как правило, не можете пополнить запасы, быстро собрав больше урожая, что иногда можно сделать на придорожных прилавках. Кроме того, дождливый фермерский рыночный день может привести к тому, что непроданные запасы не могут быть проданы на следующий рыночный день. Кроме того, на фермерских рынках обычно есть несколько продавцов с одними и теми же продуктами. Это может быть хорошо или плохо для вас. Другие поставщики могут помочь привлечь клиентов, но они также могут быть прямыми конкурентами. Вы должны смотреть на рынок, чтобы увидеть, как ваши продукты будут конкурировать.
• Самовывоз, иногда называемый U-pick, требует наименьшего труда и капитала фермера для рыночных условий. Ваши клиенты выполняют большую часть маркетинговой функции и собирают урожай. Этот метод хорошо работает для некоторых товаров и в некоторых местах, но не для всех культур или для всех производителей. Обычно это лучше всего работает с фруктами или овощами, которые закупаются в достаточно больших количествах для домашней переработки. Покупатели, которые хотят купить кварту клубники или полдюжины початков сладкой кукурузы для ужина, вряд ли будут покупать в магазинах, где можно забрать самому (хотя у некоторых производителей есть ограниченное количество уже собранных продуктов, доступных для продажи). покупка).Кроме того, ваша способность иметь дело с общественностью является важным фактором. Как маркетолог U-pick, вы должны быть готовы принять определенную сумму непреднамеренного ущерба, причиненного клиентами. Инструктаж и надзор за сборщиками — это задачи, с которыми некоторые производители плохо справляются. Как и в случае с придорожным маркетингом, местоположение очень важно для самовывоза. Существует ограничение на то, как далеко люди проедут до вашей фермы.
• Фермерство по подписке, по сути, заключается в заключении контрактов с производителями. Это также иногда называют сельским хозяйством, поддерживаемым сообществом (CSA).Вы «договариваетесь» напрямую с потребителем о производстве и доставке определенного овоща или фрукта. Эта система может потребовать технического обслуживания транспортного средства, хороших отношений с потребителями и наличия широкого ассортимента фруктов и овощей в течение всего сезона. Такой подход может быть хорошим способом извлечь выгоду из особых свойств ваших продуктов, таких как продукты с этнической привлекательностью, органически выращенные продукты и деликатесы. Успех фермерского хозяйства по подписке часто будет зависеть от продолжительного вегетационного периода и фантазии о том, чтобы иметь что-то ценное для потребителя в течение всего сезона.Работая с другими производителями, вы можете предоставить своим клиентам CSA более широкий ассортимент продукции, чем вы можете вырастить самостоятельно. Это поможет укрепить ваш бизнес, снизить риски и поддержать других местных фермеров.

Качество – ключ к успеху в маркетинге

Цена и качество являются синонимами в производстве фруктов и овощей. К сожалению, не всегда легко понять, что подразумевается под «высоким качеством», и оценка качества часто меняется из года в год. Федеральные стандарты качества не существуют для всех садовых культур, а те, у которых они есть, часто не очень специфичны.Часто существует только один признанный класс качества, № 1 в США, что означает, что продукция имеет «хорошее среднее качество». Однако покупатели и потребители часто имеют дополнительные критерии, по которым они оценивают качество продукции, включая вкус, спелость, запах, чистоту и наличие насекомых и посторонних материалов.

Надлежащая борьба с болезнями, методы сбора урожая (включая инструктаж и надзор сборщиков) и послеуборочная обработка имеют решающее значение для успеха маркетинга. Охлаждение продуктов для отвода тепла в поле и увеличения срока хранения особенно важно.Еще одним важным соображением может быть лечение для уменьшения распада. Сортировка и мытье некоторых фруктов и овощей также могут помочь сохранить качество и улучшить внешний вид. Для некоторых культур, таких как мелкие фрукты и другие деликатные продукты, сортировка и/или мытье не подходят; Бригады по сбору урожая должны быть хорошо обучены, а их качество должно постоянно контролироваться, чтобы обеспечить товарный урожай.

Надлежащая сельскохозяйственная практика (GAP) и Надлежащая практика обработки (GHP) — это добровольные программы, которые вы можете использовать для своей деятельности.Идея этих программ состоит в том, чтобы обеспечить более безопасную продовольственную систему в свете предыдущих вспышек болезней пищевого происхождения, вызванных зараженными продуктами. Кроме того, несколько крупных сетей распределения продуктов питания начинают требовать от своих производителей продукции, сертифицированной GAP и GHP. Многие требования касаются гигиены труда, использования навоза и качества воды, используемой для орошения и мытья продукции.

Эти программы потребуют проверки со стороны Департамента сельского хозяйства вашего штата, и за эту проверку взимается плата.Перед инспекцией вам необходимо разработать и внедрить план обеспечения безопасности пищевых продуктов и назначить ответственного за выполнение этого плана. Один из компонентов сертификации заключается в том, что вам необходимо будет проверять систему водоснабжения не реже двух раз в год. Другим компонентом, среди прочего, является полевая санитария для сборщиков урожая. Для получения дополнительной информации о программах GAP и GHP обратитесь в местный отдел распространения знаний, Департамент сельского хозяйства штата или на веб-сайт Службы сельскохозяйственного маркетинга Министерства сельского хозяйства США (www.ams.usda.gov; поиск «Надлежащая практика обращения»).

Для получения дополнительной информации

• Барч, Дж. А. и Р. Клайн. Обработка продукции для прямого маркетинга . Итака, Нью-Йорк: Северо-восточная служба сельскохозяйственной инженерии, 1992.
• Данн, Дж. В., Дж. В. Берри, Л. Ф. Киме, Р. М. Харш и Дж. К. Харпер. Развитие придорожного рынка . Университетский парк: Государственный университет Пенсильвании, 2006 г.
• Данн, Дж. В., Дж. К. Харпер и Л. Ф. Ким. Кооперативы .Университетский парк: Государственный университет Пенсильвании, 2005 г.
• German, C., et al. Руководство по планированию фермерского розничного рынка . Ньюарк: Сельскохозяйственная экспериментальная станция кооперативной службы распространения знаний Университета Делавэра, 1994.
• How, RB Маркетинг свежих фруктов и овощей . Нью-Йорк: Springer-Velag, 1991.
• Киме, Л. Ф., Дж. А. Адамик, Э. Э. Ганц и Дж. К. Харпер. Страхование сельскохозяйственных предприятий . Юниверсити-Парк, Пенсильвания: Государственный университет Пенсильвании, 2004 г.
• Киме, Л. Ф., В. В. МакГи, С. М. Богаш и Дж. К. Харпер. Разработка бизнес-плана . Университетский парк: Государственный университет Пенсильвании, 2004 г.
• Ли, А. В. и П. Форман. Садоводство на заднем дворе: руководство для предпринимателей по продаже того, что вы выращиваете . Buena Vista, VA: Good Earth Publications, 1995.
• Selders, A.W., et al. Помещения для придорожных рынков . Итака, Нью-Йорк: Северо-восточная региональная сельскохозяйственная инженерная служба, 1992.
• Tronstad, R. Справочник по прямому фермерскому маркетингу и туризму . Тусон: Аризонский университет, 2007.
• Уилсон, К.Л., изд. Интеллектуальная и активная упаковка для фруктов и овощей . Florence, Ky.: Taylor and Francis, 2007.

Веб-сайты

Авторы

Подготовлено Джеймсом Данном, профессором экономики сельского хозяйства; Джейсон Харпер, профессор экономики сельского хозяйства; и Линн Киме, старший сотрудник по вопросам расширения.

Эта публикация была подготовлена ​​в рамках Проекта малых и неполных фермерских хозяйств штата Пенсильвания при поддержке Университета США.S. Департамент сельского хозяйства – Служба распространения знаний.

Антидиабетические эффекты Momordica charantia (горькая дыня) и ее лечебная активность

3.2. Питательный профиль

Горькая дыня — мощное, богатое питательными веществами растение, состоящее из сложного набора полезных соединений. К ним относятся биоактивные химические вещества, витамины, минералы и антиоксиданты, которые способствуют его удивительной универсальности в лечении широкого спектра заболеваний. Плоды содержат большое количество витамина С, витамина А, витамина Е, витаминов В1, В2 и В3, а также витамина В9 (фолиевой кислоты).Калорийность листьев, плодов и семян составляла 213,26, 241,66 и 176,61 ккал/100 г соответственно[22].

Плод также богат минералами, включая калий, кальций, цинк, магний, фосфор и железо, и является хорошим источником пищевых волокон (монография о горькой дыне, 2008 г.). Лекарственная ценность горькой дыни объясняется ее высокими антиоксидантными свойствами, частично благодаря фенолам, флавоноидам, изофлавонам, терпенам, антрохинонам и глюкозинолатам, которые придают горький вкус [23].

3.3. Фитохимия

Основными компонентами горькой дыни, которые отвечают за антидиабетические эффекты, являются тритерпены, протеиды, стероиды, алкалоиды, неорганические, липидные и фенольные соединения [24], [25]. Несколько гликозидов были выделены из стебля и плодов M. charantia и сгруппированы в роды тритерпеноидов кукурбитанового типа [26], [27]. В частности, четыре тритерпеноида обладают АМФ-активируемой протеинкиназной активностью, что является правдоподобным гипогликемическим механизмом М.charantia [27].

Плоды M. charantia состоят из гликозидов, сапонинов, алкалоидов, восстанавливающих сахаров, смол, фенольных компонентов, нелетучих масел и свободных кислот[28]. M. charantia состоит из следующих химических компонентов, включая алкалоиды, чарантин, харин, криптоксантин, кукурбитины, кукурбитацины, кукурбитаны, циклоартенолы, диосгенин, элеостеариновые кислоты, эритродиол, галактуроновые кислоты, гентизиновую кислоту, гоягликозиды, гоясапонины, ингибиторы гуанилатциклазеина, гидрокситриптамины, карунидиолы, ланостерол, лауриновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, моморхаразиды, моморхарины, моморденол, момордициллин, момордицин, момордицинин, момордикозиды, момордин, момордола, мультифлоренол, миристиновая кислота, неролидол, олеаноловая кислота, олеиновая кислота, щавелевая кислота, пентадекан , пептиды, петрозелиновая кислота, полипептиды, белки, рибосомоинактивирующие белки, розмариновая кислота, рубиксантин, спинастерол, стероидные гликозиды, стигмаста-диолы, стигмастерол, тараксерол, трегалоза, ингибиторы трипсина, урацил, вацин, в-инсулин, вербаскозид, вицин, зеатин, зеатинрибозид, зеаксантин, зеиноксантин аминокислоты-аспарагиновая кислота, серин, глу таминовая кислота, тцинн, аланин, g-аминомасляная кислота и пипеколиновая кислота, аскорбиген, b-ситостерол-d-глюкозид, цитруллин, эластерол, флавохром, лютеин, ликопин, пипеколиновая кислота.Мякоть плодов содержит растворимый пектин, но не содержит свободной пектиновой кислоты. Исследования показали, что листья являются питательными источниками кальция, магния, калия, фосфора и железа; и съедобные плоды, и листья являются отличными источниками витаминов группы В[29].

3.4. Биоактивные соединения

Основываясь на множестве заболеваний, которые может лечить горькая дыня, ученые все больше и больше интересуются изучением ее биологически активных соединений и их действием на организм. Однако, как сообщается во многих исследованиях, большое внимание уделялось антидиабетическим соединениям и их гипогликемическим свойствам [30], [31].Ряд опубликованных клинических исследований показал, что экстракт горькой дыни из плодов, семян и листьев содержит несколько биологически активных соединений, обладающих гипогликемической активностью как у животных с диабетом, так и у людей [32], [33].

Момордицин II и 3-гидроксикукурбита-5, 24-диен-19-ал-7, 23-ди-О-β-глюкопиранозид (4) были выделены в виде сапонинов из M. charantia . Оба соединения проявляли значительную активность по высвобождению инсулина в β-клетках MIN6 при концентрации 10 и 25 мкг/мл [34].Основные соединения, которые были выделены из горькой дыни и идентифицированы как гипогликемические средства, включают чарантин, полипептид-р и вицин.

3.4.1. Чарантин

Чарантин представляет собой типичный тритерпеноид кукурбитанового типа в M. charantia и является потенциальным веществом с антидиабетическими свойствами[35],[36]. Питифанпонг и др. продемонстрировали, что чарантин можно использовать для лечения диабета и потенциально может заменить лечение [37]. Это смесь двух соединений, а именно ситостерилглюкозида и стигмастерилглюкозида[37].Чен и др. выделил 14 кукурбитановых тритерпеноидов, кугуацинов, в том числе два пентаноркукурбитацина, один октаноркукурбитацин и два триноркукурбитацина, а также шесть известных аналогов из виноградных лоз и листьев M. charantia [38]. Чарантин из плодов горькой дыни экстрагировали и оценивали методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии [39].

Исследования показали, что это соединение более эффективно, чем пероральное гипогликемическое средство толбутамид[12].В исследовании два агликона чарантина были выделены и идентифицированы как ситостерол и стигмастадиеноловые гликозиды, однако при отдельном тестировании их гипогликемических эффектов in vivo эти два компонента не вызывали каких-либо заметных изменений уровня глюкозы в крови [40]. Это указывает на то, что чарантин может содержать другие специфические компоненты, которые еще предстоит идентифицировать и которые ответственны за гипогликемическую активность, наблюдаемую у диабетиков.

3.4.2. Полипептид-р

Горькая дыня — один из наиболее часто используемых овощей, содержащих полипептид-р и используемый для естественного контроля диабета[41].Полипептид-р или р-инсулин представляет собой инсулиноподобный гипогликемический белок, который, как показано, снижает уровень глюкозы в крови у песчанок, лангуров и людей при подкожном введении [42]. Р-инсулин работает, имитируя действие человеческого инсулина в организме, и поэтому может использоваться в качестве заменителя инсулина на растительной основе у пациентов с диабетом 1 типа [43]. Недавно Wang et al. клонировали и экспрессировали последовательность гена длиной 498 п.н., кодирующую ген p полипептида M. charantia , а также доказали гипогликемический эффект рекомбинантного полипептида у мышей с индуцированным аллоксаном диабетом [44].Пероральный прием экстракта семян горькой дыни вызывает гипогликемический эффект у крыс с диабетом 1-го типа, индуцированным стрептозотоцином (СТЗ) [32]. Это указывает на то, что соединения в семенах горькой дыни, отличные от р-инсулина, также могут быть эффективны при лечении диабета 1 типа.

3.4.3. Вицин

Другим важным соединением, выделенным из семян горькой дыни, является алкалоид гликоля, известный как вицин[45]. Было показано, что этот пиримидиновый нуклеозид вызывает гипогликемию у крыс без диабета натощак при внутрибрюшинном введении [46].Однако было показано, что вицин, содержащийся в фасоли, вызывает фавизм, острое заболевание, характеризующееся гемолитической анемией, у лиц с наследственной утратой фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [47]. Хотя сообщений о фавизме, вызванном горькой дыней, не поступало, людям, восприимчивым к этой болезни, следует избегать употребления этого фрукта. Необходимы дальнейшие исследования для обеспечения безопасности и эффективности использования вицина для лечения гипергликемии.

3.4.4. Другие компоненты

Многие другие компоненты горькой дыни были идентифицированы и выделены с помощью различных методов экстракции.Первое исследование, показавшее гипогликемическую активность основных соединений горькой дыни in vivo , было проведено группой японских ученых. Они выделили 11 соединений путем фракционирования метанольного экстракта из сушеных плодов горькой дыни. Была определена структура трех тритерпеноидов кукурбитана, а также двух других основных соединений, которые были протестированы и показали, что они значительно снижают уровень глюкозы в крови у мышей с диабетом [21]. Четыре соединения, которые могут быть ответственны за горький вкус растения, были выделены и идентифицированы как момордикозиды K и L и момордицины I и II.Два последних выделенных соединения были идентифицированы как ситостерол и стигмастадиенол, агликоны чарантина [40].

Митоз и мейоз: основные различия, схема и диаграмма Венна

Деление клеток происходит как часть «клеточного цикла». Точно так же, как в вашем дне есть распорядок дня и ночи, у клеток есть свой собственный распорядок. Клеточный цикл обычно описывается как состоящий из четырех основных фаз: G1, S-фазы, G2 и митоза (или мейоза). Клетки также могут сделать перерыв в клеточном цикле в состоянии, называемом G0 или старением (обратите внимание, что некоторые клетки постоянно находятся в G0).Внешние факторы роста могут стимулировать клетки в G1 или G0 к прохождению остальной части цикла, например, фактор роста нервов (NGF), который способствует росту нейронов. Точка рестрикции — это особая «точка невозврата» в G1, когда клетки больше не реагируют на удаление факторов роста и будут продолжать прогрессировать в S-фазу, несмотря ни на что. Существуют также внутренние сигналы, которые сообщают клетке о прогрессе, эти белки называются циклинами, а циклин, способствующий митозу, называется циклином В.S-фаза особенно важна, так как это точка, в которой весь геном клетки дублируется в процессе полуконсервативной репликации ДНК.

Стадии митоза: интерфаза, профаза, метафаза, анафаза и телофаза, иногда с последующим цитокинезом. «Интерфаза» — это общий термин, который описывает все стадии перед митозом, то есть фазы G1, S и G2. Стадии мейоза: интерфаза, профаза I, метафаза I, анафаза I, телофаза I, цитокинез I, профаза II, метафаза II, анафаза II, телофаза II и, наконец, цитокинез II.См. наше подробное объяснение ниже:

Митоз и мейоз Диаграмма Венна

 

Активные вопросы исследования

Процесс клеточного деления — это сложный танец молекулярных механизмов, который очаровывал исследователей на протяжении сотен лет. Достижения в области микроскопии оказали огромное влияние на эту область, от ее скромного начала наблюдения метафазных хромосом под световым микроскопом до более сложных современных технологий, которые могут задавать вопросы на молекулярном уровне.Исследования клеточного цикла также были высоко оценены: Нобелевская премия по физиологии и медицине 2001 г. была присуждена Тиму Ханту, Полу Нерсу и Леланду Хартвеллу за их совместное открытие циклинов и циклинзависимых киназ : ключевых регуляторов. клеточного цикла [6]. Однако, несмотря на наш прогресс, остается много вопросов.

Как клетки способствуют правильному расхождению хромосом в митозе?

В то время как митоз может пройти только одним способом, есть много способов, чтобы он пошел неправильно.Например, в начале митоза при неправильных контактах между микротрубочками и хромосомами хромосомы могут смещаться, что может приводить к неправильному расхождению сестринских хроматид. Как в позднем митозе клетка может быть уверена, что настало время для цитокинеза? Комплекс хромосомных пассажиров (CPC) — это молекулярный ангел-хранитель, который действует на многих стадиях митоза, чтобы гарантировать точность процесса. В начале митоза CPC локализуется во всех хромосомах и модифицирует хроматин, во время митоза он перемещается к центромерам хромосом, чтобы предотвратить неправильное прикрепление микротрубочек, а перед цитокинезом CPC находит путь к центральному веретену.Таким образом, вопрос продолжающихся исследований заключается в том, как CPC элегантно перемещается по всему митозу, чтобы спасти положение?

Дополнительная литература 

• Вейдер Г., Медема Р. Х. и Ленс С. М. (2006). Хромосомный комплекс-пассажир: сопровождение Aurora-B через митоз. Журнал клеточной биологии, 173(6), 833-837.

•Кабече, Л., Нгуен, Х.Д., Буиссон, Р., и Цзоу, Л. (2018). Специфичный для митоза и управляемый R-петлей путь ATR способствует правильному расхождению хромосом. Наука, 359(6371), 108-114.

Как гомологичные хромосомы удерживаются вместе, а затем разделяются в мейозе I?

Возможно, вы помните из вышеизложенного, что именно белок cohesin удерживает вместе сестринские хроматиды в метафазе митоза и метафазе II мейоза. Однако в мейозе I гомологичных хромосом должны удерживаться вместе в метафазе I, прежде чем эти связи будут быстро разорваны во время анафазы I. Этот подвиг осуществляется чудесной клеточной застежкой-молнией, называемой синаптонемным комплексом (SC).Эта застежка-молния должна быть достаточно прочной, чтобы удерживать хромосомы вместе, но она также должна быть столь же эффективно разобрана, иначе гомологичные хромосомы не будут точно разделяться в анафазе I, что приведет к потенциально катастрофическому генетическому неравенству в дочерних клетках. Как именно эта молния разбирается, является горячей темой исследований.

Дополнительная литература 

• Аргунхан Б., Цубоути Т. и Цубоути Х. (2018). Поло не соло в мейозе. Клеточный цикл, 17(3), 273-274.

• Гао, Дж., и Колайаково, член парламента (2017). Сжатие и расстегивание: модификации белков, регулирующие динамику синаптонемного комплекса. Тенденции в генетике.

Ссылки

1) Bennett, M.D. (1977). Время и продолжительность мейоза. Фил. Транс. Р. Соц. Лонд. В, 277(955), 201-226.

2) Джетт, Дж. Х. (2015). Сколько времени требуется клетке для деления? Цитометрия Часть А, 87(5), 383-384.

3)Брюэр, Б.Дж., Хлебович-Следзевска, Э., и Фангман, В.Л. (1984). Фазы клеточного цикла в неравных материнских/дочерних клеточных циклах Saccharomyces cerevisiae. Молекулярная и клеточная биология, 4(11), 2529-2531.

4) Клифт, Д., и Шу, М. (2013). Возобновление жизни: оплодотворение и переход от мейоза к митозу. Обзоры природы Молекулярная клеточная биология, 14(9), 549.

5)Павелец, Н. (2001). Вальтер Флемминг: пионер исследования митоза. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2(1), 72.

6) Медсестра, П. М. (2002). Нобелевская лекция: Циклинзависимые киназы и контроль клеточного цикла.Отчеты о биологических науках, 22(5), 487-499.

Как сделать батарейку из фруктов

Если у вас есть фрукт, пара гвоздей и провод, то вы можете произвести достаточно электричества, чтобы зажечь лампочку. Сделать фруктовую батарейку весело, безопасно и просто.

Что вам нужно

Для изготовления батареи вам понадобится:

• Цитрусовые (например, лимон, лайм, апельсин, грейпфрут)
• Медный гвоздь, винт или проволока (длиной около 2 дюймов или 5 см)
• Цинковый гвоздь или шуруп или оцинкованный гвоздь (около 2 дюймов.или длиной 5 см)
• Небольшой праздничный светильник с проводами длиной 2 дюйма или 5 см (достаточно провода, чтобы соединить его с гвоздями)

Сделать фруктовую батарейку

Вот как сделать аккумулятор:

1. Положите фрукты на стол и осторожно покатайте их, чтобы они стали мягкими. Вы хотите, чтобы сок текла внутри фрукта, не нарушая его кожуры. Как вариант, можно сжать фрукт руками.
2. Вставьте цинковые и медные гвозди в фрукты так, чтобы они находились на расстоянии около 2 дюймов (5 сантиметров) друг от друга.Не позволяйте им касаться друг друга. Избегайте прокалывания конца плода.
3. Снимите достаточное количество изоляции с проводов светильника (около 1 дюйма или 2,5 см), чтобы можно было обернуть один провод вокруг цинкового гвоздя, а другой – вокруг медного гвоздя. Вы можете использовать изоленту или зажимы типа «крокодил», чтобы провод не падал с гвоздей.
4. При подключении второго гвоздя загорится свет.

Как работает лимонная батарейка

Вот научные и химические реакции, связанные с лимонной батареей (вы можете попробовать сделать батарейки из других фруктов и овощей):

• Медь и цинк действуют как положительные и отрицательные клеммы батареи (катоды и аноды).
• Металлический цинк реагирует с кислым лимонным соком (в основном из лимонной кислоты) с образованием ионов цинка (Zn ²⁺ ) и электронов (2 e ^– ). Ионы цинка растворяются в лимонном соке, а электроны остаются на металле.
• Провода маленькой лампочки являются электрическими проводниками. Когда они используются для соединения меди и цинка, электроны, образовавшиеся на цинке, перетекают в провод. Поток электронов представляет собой ток или электричество. Это то, что питает маленькую электронику или зажигает лампочку.
• В конце концов, электроны достигают меди. Если бы электроны не пошли дальше, они бы в конце концов накопились так, что между цинком и медью не было бы разности потенциалов. Если бы это произошло, поток электричества прекратился бы. Однако этого не произойдет, потому что медь находится в контакте с лимоном.
• Электроны, накапливающиеся на медном конце, реагируют с ионами водорода (H ⁺ ), свободно плавающими в кислом соке, с образованием атомов водорода.Атомы водорода соединяются друг с другом, образуя газообразный водород.

Больше науки

Вот дополнительные возможности для исследования:

• Цитрусовые кислые, что помогает их соку проводить электричество. Какие еще фрукты и овощи, которые можно было бы использовать в качестве батареек, вы могли бы попробовать?
• Если у вас есть мультиметр, вы можете измерить ток, вырабатываемый батареей. Сравните эффективность различных видов фруктов. Посмотрите, что произойдет, если вы измените расстояние между гвоздями.
• Всегда ли кислые фрукты работают лучше? Измерьте pH (кислотность) фруктового сока и сравните его с силой тока в проводах или яркостью лампочки.
• Сравните электричество, вырабатываемое фруктами и соками. Жидкости, которые вы можете протестировать, включают апельсиновый сок, лимонад и рассол.

Знакомство с плодовыми мушками

Это руководство адаптировано из Программы общей биологии факультета биохимии и молекулярной биофизики Университета Аризоны для преподавателей естественных наук: Drosophila Melanogaster и менделевская генетика Пита Гейгера.

Знакомство с Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster — это небольшая обыкновенная муха, обитающая рядом с незрелыми и гнилыми фруктами. Он используется уже более века для изучения генетики и поведения. Томас Хант Морган был выдающимся биологом, изучавшим дрозофилу в начале 1900-х годов. Он был первым, кто открыл сцепление с полом и генетическую рекомбинацию, что выдвинуло маленькую мушку на передний план генетических исследований. Из-за небольшого размера, простоты культивирования и короткого времени генерации генетики с тех пор используют дрозофилу.

Плодовых мушек легко получить из дикой природы, и многие компании, занимающиеся биологическими науками, несут множество различных мутаций. Кроме того, эти компании продают любое оборудование, необходимое для выращивания мух. Затраты относительно низкие, и большую часть оборудования можно использовать год за годом. Можно приобрести множество лабораторных упражнений, хотя необходимость в этом сомнительна.

 

Зачем использовать дрозофилу?

Учителя должны использовать плодовых мушек для генетических исследований в старшей школе по нескольким причинам:
     1.Они маленькие и с ними легко обращаться.
     2. Их можно легко обезболить и манипулировать ими по отдельности с помощью несложного оборудования.
     3. Они имеют половой диморфизм (самцы и самки разные), поэтому различить пол довольно легко.
     4. Виргинские плодовые мушки физически отличаются от половозрелых особей, что упрощает получение девственных самцов и самок для генетического скрещивания.
     5. У мух короткое время генерации (10–12 дней), и они хорошо себя чувствуют при комнатной температуре.
     6. Уход за плодовыми мухами и их разведение требуют небольшого количества оборудования, низкой стоимости и занимают мало места даже для больших культур.

Используя Drosophila, учащиеся:
     1. Понимать менделевскую генетику и наследование признаков
     2. Делать выводы о закономерностях наследственности на основе полученных данных
     3. Создавать ловушки для поимки диких популяций D. melanogaster 9024 4 понимание жизненного цикла D. melanogaster , насекомого, демонстрирующего полную метаморфозу
     5.Создавайте скрещивания пойманных и известных диких и мутировавших мух
     6. Изучите методы манипулирования мухами, определите их пол и ведите краткие дневниковые заметки
     7. Изучите методы культивирования, чтобы сохранить здоровье мух
     8. Осознайте, что многие научные эксперименты невозможно провести и завершены в течение одного или двух лабораторных занятий

Национальные стандарты, рассматриваемые в этих уроках:
Содержание:
     1. Организмам требуется набор инструкций для определения признаков (наследственности)
     2.Наследственная информация находится в генах.
     3. Комбинации признаков могут описывать характеристики организма.

Цели учащихся:
     1. Определение вопросов и концепций, которыми руководствуются в научных исследованиях
     2. Планирование и проведение научных исследований
     3. Формулирование и пересмотр научных объяснений и моделей с использованием логики и доказательств
     4. Обсуждение и защита научных аргументов

Генетика дрозофилы хорошо задокументирована, и несколько общедоступных веб-сайтов содержат полный аннотированный геном.Таким образом, те учителя или студенты, которые хотят увидеть, где происходят их мутации, имеют готовый справочник.

Поскольку дрозофила так широко используется в генетике, существует множество различных типов мутаций, доступных для покупки. Кроме того, внимательный исследователь может обнаружить мутации в своих собственных диких культурах, поскольку из-за короткого времени генерации мутации относительно распространены по сравнению с другими видами животных.

Открытие
Домен: Eukarya
Королевство: Animalia
Класс: Animalia
Класс: Arthropoda
Класс: insecta
Заказать: Diptera
Семья: Diptera
Семья: Drosophilidae
Род: Drosophila («Любовница росы»)
вид: Melanogaster («темная гут»)

 
Жизненный цикл Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster демонстрирует полный метаморфизм, то есть жизненный цикл включает яйцо, личиночную (червеобразную) форму, куколку и, наконец, появление (закрытие) летающей взрослой особи.Это то же самое, что и известная метаморфоза бабочек. Личиночная стадия имеет три возраста или линьки.

 
День 0: Самка откладывает яйца
День 1: Вылупление яиц
День 2: Первый возраст (продолжительность один день)
День 3: Второй возраст (продолжительность один день)
День 5: Третий и последний возраст (два дней)
День 7: Личинки начинают бродячую стадию. Окукливание (образование куколки) происходит через 120 часов после откладки яиц.
День 11-12: Эклозия (взрослые особи выходят из оболочки куколки).

Самки становятся половозрелыми через 8-10 часов после вылупления

• Время генерации Drosophila melanogaster зависит от температуры. Вышеупомянутый цикл предназначен для температуры около 22°C (72°F). Мухи, выращенные при более низкой температуре (до 18 ° C или 64 ° F), развиваются примерно в два раза дольше.
• Самки могут откладывать до 100 яиц в день.
• Девственные самки способны откладывать яйца; однако они будут бесплодны и малочисленны.

После вылупления яиц в среде для выращивания должны быть видны маленькие личинки.Если среда белая, найдите маленькую черную область (ротовые крючки) на голове личинки. Некоторые предварительно смешанные сухие среды окрашены в синий цвет, чтобы помочь идентифицировать личинок, однако это не обязательно, и при небольшом терпении и практике личинки легко видны. Кроме того, во время питания личинки нарушают гладкую поверхность среды, и поэтому, глядя только на поверхность, можно сказать, присутствуют ли личинки. Тем не менее, всегда полезно перепроверить с помощью стереомикроскопа. После третьего возраста личинки начинают мигрировать вверх по культуральному флакону, чтобы окукливаться.

 

Уход, содержание и манипуляции с дрозофилой

Введение
Для включения плодовых мух в класс необходимо поддерживать культуры мух для манипуляций при скрещивании и в качестве резервной копии на случай любых возможных неудач. Выращивание мух очень просто, и рекомендуется, чтобы учащиеся поддерживали свои собственные культуры мух. Таким образом, каждый студент или группа будут нести прямую ответственность за уход и долгосрочное содержание мух, включая создание больших культурных популяций для их скрещивания.При непосредственном участии учащиеся приобретают навыки и лучше понимают требования и поведение мух. Учитель должен оставаться тренером, а не лектором, помогая ученикам в технике. Преподаватель должен поддерживать запас культур всех штаммов и мутантов, используемых учащимися, на случай, если произойдет вышеупомянутый непредвиденный инцидент и студенческие культуры вымрут или смешаются. Потеря культур является скорее исключением, чем правилом, и пока учащиеся регулярно рекультивируют своих мух и не происходит массового заражения, мухи могут сохраняться десятилетиями.

 
Бутылочки и флаконы
Томас Хант Морган использовал для своих экспериментов стеклянные бутылки из-под молока, и действительно, подойдет любая тара, включая детские баночки и разные контейнеры. Тем не менее, для простоты культивирования и переноса культур лучше всего использовать однородные флаконы и флаконы. Оба можно приобрести в магазине биологических товаров. Бутыли используются в основном для содержания больших популяций мух, тогда как пробирки для культивирования полезны для содержания небольших популяций и являются предпочтительным контейнером для создания студенческих скрещиваний.Если есть желание поддерживать исходные культуры в течение длительного периода времени или повторно использовать бутылки и флаконы, важно полностью очистить и стерилизовать их. Это необходимо для предотвращения распространения вредителей и болезней.

Чтобы очистить бутылку и флаконы, сначала заморозьте их, чтобы убить в них мух. Выньте продукты, хорошо вымойте, затем стерилизуйте в автоклаве (в течение 20 минут при 121 °C и 15 фунтов на квадратный дюйм; если контейнеры пластиковые, убедитесь, что их можно автоклавировать) или в 10% растворе хлорной извести.

Бутылки и флаконы можно приобрести различных размеров и из различных материалов.Стекло эффективно, однако, если его уронить, учащийся может потерять данные за 2 недели за одну утечку. Доступны автоклавированные (стерильные) пластиковые флаконы, которые предпочтительны для использования студентами. Размеры флаконов варьируются от 96 мм на 25 мм до больших размеров, однако меньший размер рекомендуется для скрещивания и поддержания небольших культур. Доступны различные затычки от мягкого хлопка до поролоновых затычек. Это вопрос предпочтений и стоимости, однако хлопок отлично подходит и его можно купить в местной аптеке в крайнем случае.

 
Где купить материалы:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, подразделение Genesee Scientific

 
Как они выглядят:

Стереомикроскоп

Флакон для дрозофилы

Бутылочки для дрозофилы

 
Корм ​​для мух
Первым шагом в подготовке культуральных флаконов является добавление пищевой среды.Для мух доступно множество видов пищи; некоторые требуют приготовления, а другие покупаются уже готовыми и обезвоженными. Последний можно приобрести в компании-поставщике биологических препаратов. Это, конечно, намного быстрее и проще, чем приготовление приготовленной среды, настолько, что учащиеся могут наполнить свои флаконы средой. Однако для достижения наилучших результатов его необходимо полностью регидратировать, поскольку это единственный источник воды для взрослых особей и личинок. Поэтому следуйте приведенным ниже рекомендациям, чтобы обеспечить полностью гидратированную среду:

Сухая среда
Добавьте сухую среду во флакон или флакон до объема примерно от 1/5 до 2/5.Добавляйте воду до тех пор, пока носитель не станет полностью увлажненным. Оставьте флакон на несколько минут, при необходимости добавляя воду, пока среда полностью не увлажнится. Поверхность должна быть влажной с блестящим внешним видом, в среде не должно быть пробелов. Если среда не полностью гидратирована, производство энергичных культур поставлено под угрозу. Мухи могут быть добавлены через несколько минут после гидратации среды. Не забудьте добавить несколько зерен (но не более) дрожжей на поверхность среды перед добавлением мух.

Приготовленная среда
При раздаче приготовленной среды она должна заполнять культуральный флакон, флакон или пробирку на 1/5–2/5. Оставьте среду на ночь для отверждения, накрыв флаконы тканью, чтобы дикие мухи не откладывали в них яйца. На следующий день добавить дрожжи и пробки. Охладите любые неиспользованные флаконы со средой. Приготовленную среду можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Разрешить СМИ нагреться до комнатной температуры, прежде чем добавлять мух. Не допускайте высыхания носителя.

 
Окружающая среда
Проще всего выращивать мух при комнатной температуре.Однако оптимальными условиями выращивания являются температура 25°C и влажность 60%. В этих условиях время генерации короче (9-10 дней от яйца до взрослой особи). Если оборудование не имеется в наличии, в нем нет необходимости для успешного выращивания и скрещивания мух. Желательно держать мух подальше от сквозняков и прямых солнечных лучей или источников тепла. Это быстро высушит среду, что потребует частой смены среды и может привести к обезвоживанию мух.

 
Обезболивающие мухи
Проблема с плодовыми мушками в том, что они летают! Поэтому были разработаны различные методы анестезии мух.Включая эфир, коммерческие бренды, такие как Flynap, углекислый газ и охлаждение. У каждого есть свои сильные и слабые стороны. Эфир легко воспламеняется, имеет резкий запах и убивает мух, если они перенасыщены эфиром (и может обезболить младших школьников!). Flynap от Carolina Biological грязный и имеет неприятный запах. Однако каждый из них требует недорогого оборудования, которое можно легко приобрести. Углекислый газ работает очень хорошо, сохраняя неподвижность мух в течение длительного периода времени без побочных эффектов, однако коврики (блоки) CO ₂ дороги, а источник CO ₂ (обычно бутылка) и система доставки (флаконы и зажимы) необходимы, увеличивая затраты.Если вы находчивы, можно использовать CO ₂ , выделяемый таблетками Алка-Зельтцер, для анестезии мух на короткие промежутки времени. Настройте большую пробирку с трубкой и пробкой. Добавьте воду в пробирку, затем таблетку Алка-Зельтцер. Будет выделяться углекислый газ.

Наименее вреден для мух либо углекислый газ, либо охлаждающее обезболивающее. Из этих двух вариантов охлаждение является самым простым, требующим только морозильной камеры, льда и чашек Петри. Кроме того, это единственный метод, который не влияет на неврологию мух, поэтому исследования поведения можно начинать после того, как мухи достаточно согреются.

 
Обезболивание мух путем охлаждения
Чтобы вывести мух из строя, поместите пробирку с культурой в морозильную камеру до тех пор, пока мухи не перестанут двигаться, обычно на 8–12 минут. Высыпьте мух на охлажденную поверхность. Это можно построить, используя верхнюю часть чашки Петри, добавив дробленый лед, а затем поместив дно чашки Петри сверху. Добавление мух в эту систему позволит им оставаться охлажденными достаточно долго, чтобы проводить каждый эксперимент. Просто поместите мух обратно в пробирку с культурой, когда закончите.Мухи относительно быстро «просыпаются» после отрыва ото льда, поэтому держите их в холоде. У этого метода нет длительных побочных эффектов, хотя мухи, оставленные в холодильнике слишком долго, могут не восстановиться. Еще один способ охладить мух — налить воду в пакеты для заморозки с застежкой-молнией, поместить их в морозильную камеру с чашкой Петри, прижатой к пакету, и дать им замерзнуть.

 
Пересадка мух из одного флакона в другой
Мух следует пересаживать каждые 10–14 дней. Учащиеся должны поддерживать резервную культуру своих мух, а инструктор должен поддерживать резервные исходные культуры всех штаммов мух.Существует два основных способа переноса мух при формировании новых культур. Требуется не обезболивающее, а быстрые руки.
A) ​​Поместите воронку в горлышко флакона со свежей культурой, в который уже добавлена ​​среда. В старом флаконе (тот, в котором были мухи) осторожно постучите по мухам, мягко постукивая флаконом по мягкой поверхности, например по коврику для мыши. Мухи упадут на дно и останутся там в течение нескольких секунд (не более!), достаточного времени, чтобы быстро снять пробку с флакона, перевернуть его в воронку и аккуратно утрамбовать вместе два флакона, чтобы заставить слетает в новый флакон.
B) Альтернативный способ – положить мух в морозильную камеру примерно на 8 минут. Это заставит мух впасть в состояние оцепенения. Поместив воронку на новый флакон, переверните флакон с неподвижными мухами в воронку. Это не так весело, но мухи не будут летать по классу.

 
Определение пола мух
Довольно легко отличить самцов от самок, и после небольшой практики ученики убедятся в своей способности это делать.Обратите внимание, что самцы, как правило, меньше и имеют более темный и округлый живот. Легче всего распознать окраску брюшка. Кроме того, у самцов есть предплюсневые половые гребни на первой паре ног. Они черные и очень характерные, но их можно увидеть только при относительно большом увеличении. Немного потренировавшись и глядя на брюшко, ученики научатся точно определять пол мух. Определение пола мух имеет решающее значение при скрещивании, поэтому убедитесь, что ученик уверен в определении различий между полами.Чтобы учащиеся чувствовали себя комфортно при определении пола мух, дайте или попросите их получить 25 или более смешанных половых мух и позвольте им разделить мух на две кучки, самцов и самок. Другие студенты в группе и преподаватель должны проверить сортировку. Каждый член группы должен уметь заниматься сексом с мухами.

 
Фотографии самцов и самок

Самец (вверху) и самка (внизу), вид снизу.

Самец (вверху) и самка (внизу), вид сбоку.

Обратите внимание на более темный живот и более округлый вид самца. Самки также имеют тенденцию быть крупнее.

 
Сбор девственных самок
Хотя поместить девственных самок к самцам несложно, важно учитывать фактор времени, связанный с получением девственниц. Самки остаются девственными только в течение 8-10 часов после закрытия и должны быть собраны в течение этого периода времени. ПРИМЕЧАНИЕ. Самки способны сохранять сперму после однократного спаривания, поэтому, если самка для скрещивания не является девственницей, вы не будете знать генотип самца, использованного для вашего скрещивания.Настоятельно рекомендуется приобретать экстра-девственниц на случай, если при идентификации будет допущена ошибка или муха погибнет до спаривания и откладывания яиц. В сильной культуре должно быть легко получено несколько девственных самок. Хотя самки могут откладывать яйца как девственницы, они будут стерильными, и личинки не произойдут. Ниже приведены три способа получения девственниц, «метод удаления» наиболее рекомендуется для начинающих.

 
Метод удаления
Удалите всех мух за 8–10 часов до сбора (обычно это делается утром).Визуально осмотрите поверхность пищи, чтобы убедиться в полном удалении мух. Через 8-10 часов (обычно перед уходом с работы) соберите всех присутствующих самок. Все будут девственницами. Поместите в пробирку со свежей культурой и подождите 2-3 дня в поисках личинок. Девственные самки могут откладывать яйца, но они будут стерильными. Поскольку они чувствительны к фотопериоду, самки обычно закрываются рано утром. Поэтому ранние коллекции обеспечат наибольшее количество девственниц для экспериментов. Тем не менее, сбор возможен позже в тот же день.

 
Визуальный метод
Способность распознавать девственных самок избавляет от необходимости своевременно опорожнять флаконы с культурами и позволяет учащимся собирать свои собственные культуры без необходимости приходить на занятия в неурочное время дня. Обратите внимание, что девственные самки намного крупнее пожилых самок и не имеют темной окраски зрелых самок. Кроме того, в первые часы после закрытия на нижней стороне брюшка будет видно темное зеленоватое пятно (меконий, остатки их последней еды перед окукливанием).

 
Циклическое изменение температуры
С помощью циклического изменения температуры можно увеличить количество девственниц в утреннем сборе. Когда культуры поддерживаются при температуре 18°C, развитие замедляется, поэтому самки не спариваются раньше, чем через 16 часов после огораживания. Удаляя мух днем/вечером и помещая флаконы в инкубатор при 18°C, 98% мух, полученных утром, будут девственными. Помещение девственниц в их собственные флаконы на 2-3 дня устранит те 2%, которые не являются девственницами.

 
Фотографии девственных мужчин и женщин:

Недавно запертая женщина. Это «влажная» стадия, когда муха липкая на ощупь.
Крылья и тело выглядят мокрыми.

Непорочная женщина с меконием (стрелка).
Меконий представляет собой темно-зеленую область и представляет собой остатки пищи личинок. Это вскоре после закрытия; после 4+ часов становится все труднее определить разницу между ними.
Обратите внимание на меконий на девственнице.

Сравнение зрелого (вверху) и девственного (внизу) мужчины. Окраска похожа на девственных самок, однако гениталии заметно отличаются. Меконий также обнаруживается у молодых девственных мужчин, как и у женщин.

Скрещивание мух
Когда самки считаются девственницами, добавьте самцов. При скрещивании идеальным является соотношение девственных самок и самцов 3:1. Как правило, самцы спариваются более эффективно, если они созрели 3 дня или дольше.Обязательно выбирайте крепких, здоровых самцов; чем старше мухи, тем ниже эффективность спаривания. Спаривание происходит быстро, и за поведением интересно наблюдать, но здесь мы его рассматривать не будем. Самки начинают откладывать оплодотворенные яйца вскоре после спаривания. Обратитесь к диаграмме жизненного цикла, чтобы узнать о личинках F1. Удалите взрослых особей, как только будет установлено, что присутствует достаточное количество личинок (обычно через 7-8 дней после скрещивания), так как вы, возможно, не сможете отличить родителей от поколения F1.

 
Убийство мух: Морг
Это досадная необходимость при использовании мух.Обычно используется бутылка или химический стакан с мыльной водой или минеральным маслом. Сбрасывайте анестезированных мух прямо в мыльную воду или минеральное масло, где они тонут. Бутылка (стакан или банка с завинчивающейся крышкой), наполненная этанолом или изопропанолом, также может использоваться в качестве морга.

 
Основная генетическая номенклатура и определения дрозофилы

Мухи Drosophila melanogaster имеют 4 хромосомы.
Генотип записывается как:

Хромосома
Хромосома или хромосома/хромосома

Эта общепринятая номенклатура показывает одну хромосому вверху и ее гомолог внизу, так как хромосомы появляются во время мейоза при формировании гамет.

При написании генотипа, как правило, хромосомы разделяются точкой с запятой.

Х-хромосома; хромосома II; хромосома III; хромосома IV

Дикий тип обозначается как «+» или WT

Доминантные мутации пишутся с заглавной буквы:
Например: Bar или B

Рецессивные мутации пишутся со строчной буквы:
Например: белый или w

Мутации — это аллели (альтернативные формы гена, занимающие данный локус на хромосоме), которые наследуются вместе с хромосомами.

Гомозиготный – индивидуум с одинаковым аллелем в соответствующих локусах гомологичных хромосом.

Гетерозигота – Человек с разными аллелями в соответствующих локусах гомологичных хромосом.

Генотип – Гены, которыми обладает организм.

Фенотип – наблюдаемые признаки организма.

P1 — Родительское поколение.

F1 — Дочернее поколение или потомственное поколение. F1 – первое потомство поколения.

F2 — Второе поколение потомков.

 
Другие важные веб-ресурсы:

Джерард Мэннинг написал простое введение в генетику дрозофилы.

Генетика на лету: Учебник по системе моделей дрозофилы Карен Г. Хейлз и др. (2015).

Подведение итогов исследовательской экосистемы дрозофилы Дэвида Билдера и Кеннета Д. Ирвина (2017).

FlyBase — это энциклопедический ресурс для исследователей дрозофилы с подробной информацией о популяциях мух, генах, мутантах, исследователях, публикациях и многом другом.

11 зеленых продуктов (и 1 напиток), которые полезны для вас

Кале принадлежит к семейству продуктов, известных как овощи семейства крестоцветных (причудливое название семейства капустных).

Хотя капуста часто вызывает много шума в мире диетологии, на то есть веская причина. «Кале обладает впечатляющим набором питательных веществ, — говорит Натали Риццо, доктор медицинских наук, основательница компании Nutrition à la Natalie из Нью-Йорка.

Одна чашка сырой капусты без упаковки содержит 1 г клетчатки, согласно данным Министерства сельского хозяйства США, что составляет почти 4 процента от вашей суточной нормы.

Капуста также содержит 176 мкг витамина К, что выше суточной нормы (120 мкг). И это важно, потому что витамин К помогает в свертывании крови и поддерживает здоровье ваших костей, наряду со многими другими преимуществами для здоровья, согласно NIH.

По данным Министерства сельского хозяйства США, вы также получите 30 мг витамина С, что составляет около 33 процентов от вашей суточной нормы, что делает его отличным источником. Кроме того, NIH отмечает, что витамин С помогает защитить клетки, которые в противном случае были бы повреждены свободными радикалами.Витамин С также может способствовать выработке белка, необходимого для заживления ран, и помогает иммунной системе работать должным образом, что помогает бороться с болезнями.

Кроме того, исследование, опубликованное в сентябре 2016 года в Biomedical Reports , показало, что употребление капусты может подавлять повышение уровня глюкозы в крови после еды, а это означает, что капуста может помочь регулировать уровень сахара в крови и помочь вам чувствовать себя сытым, говорит Риццо.

Помимо всего этого, соединения в капусте, называемые глюкозинолатами, расщепляются в процессе пищеварения и образуют соединения, называемые «индолами» и «изотиоцианатами», которые, как известно, останавливают рост некоторых видов рака в исследованиях на животных и в лабораторных условиях. Институт рака.Исследования на людях, изучающие крестоцветные овощи и способность снижать риск рака, неоднозначны, и Национальный институт рака отмечает, что необходимо провести дополнительные исследования (но есть некоторый потенциал для предотвращения некоторых видов рака, таких как простата, колоректальный рак, рак легких и молочной железы). , говорится).

Ищете способы насладиться капустой? «Лично я предпочитаю вареную капусту и добавляю ее в блюда из макарон для получения дополнительных питательных веществ», — говорит Риццо. (Попробуйте ее макароны с рикоттой и капустой сегодня вечером!)

СВЯЗАННЫЕ: 10 рецептов здоровой и приятной пасты

Искусство использования t-SNE для транскриптомики отдельных клеток

Сохранение глобальной геометрии с t-17 90

Чтобы проиллюстрировать, что t-SNE по умолчанию имеет тенденцию искажать глобальную геометрию, мы сначала рассмотрим игрушечный пример (рис.1). Этот синтетический набор данных состоит из точек, выбранных из пятнадцати 50-мерных сферических распределений Гаусса, сгруппированных в три отдельных и непересекающихся класса. Данные генерируются таким образом, что типы внутри двух классов (\(n=100\) и \(n=1000\) на тип соответственно) не перекрываются, а типы внутри третьего класса (\(n=2000\) ) для каждого типа) частично перекрываются. В результате этот набор данных имеет иерархическую структуру, типичную для данных scRNA-seq.

Рис. 1

Синтетический набор данных.Точки были выбраны из смеси пятнадцати 50-мерных распределений Гаусса. Общий размер выборки n  = 15 500. a Многомерное масштабирование 15 классов означает. Размер баллов пропорционален количеству баллов в классе. b Первые два главных компонента данных. Цвета точек обозначают принадлежность к классу. KNN: \(10\)-сохранение ближайших соседей, KNC: \(4\)-сохранение ближайших классов, CPD: корреляция Спирмена между попарными расстояниями. c t-SNE по умолчанию с недоумением 30, случайной инициализацией и скоростью обучения 200. d Т-СНЭ с недоумением \(n/100=155\). e T-SNE с инициализацией PCA. f T-SNE с многоуровневым сходством (комбинация недоумения 30 и \(n/100=155\)), инициализацией PCA и скоростью обучения \(n/12 \приблизительно 1300\).

Двумя классическими методами визуализации многомерных данных являются многомерное масштабирование (MDS) и анализ главных компонентов (PCA). MDS трудно вычислить с большим количеством точек (здесь n  = 15 500), но его легко применить к средним классам (\(n=15\)), ясно показывая три различных класса (рис.1а). PCA может быть применен ко всему набору данных и демонстрирует ту же крупномасштабную структуру данных (рис. 1b), но в первых двух PC невозможно увидеть структуру внутри класса. Напротив, t-SNE четко показывает все 15 типов, правильно отображая десять из них как полностью изолированные и пять как частично перекрывающиеся (рис. 1c). Однако изолированные типы в конечном итоге размещаются произвольно, и их положение в основном зависит от случайного начального числа, используемого для инициализации.

Чтобы количественно оценить качество или достоверность данного вложения, мы использовали три различных показателя: как \(k\)-ближайшие соседи во вложении ²² .Мы использовали \(k=10\) и вычислили среднее значение по всем \(n\) точкам. KNN количественно определяет сохранение локальной или микроскопической структуры.

KNC

Доля \(k\)-ближайших средних классов в исходных данных, которые сохраняются как \(k\)-ближайшие средние классы при вложении. Это вычисляется только для среднего класса и усредняется по всем классам. Для синтетического набора данных мы использовали \(k=4\), а для анализируемых ниже реальных наборов данных мы использовали \(k=10\). KNC количественно определяет сохранение мезоскопической структуры.

CPD

Корреляция Спирмена между попарными расстояниями в многомерном пространстве и во вложении ¹¹ . Рассчитано по всем 499 500 парам среди 1000 случайно выбранных точек. CPD количественно определяет сохранение глобальной или макроскопической структуры.

Применение этих показателей к вложениям PCA и t-SNE (рис. 1b, c) показывает, что t-SNE намного лучше, чем PCA, в сохранении локальной структуры (KNN 0,13 против 0,00), но намного хуже в сохранении глобальная структура (KNC 0.23 против 1,00 и CPD 0,51 против 0,85). Наш рецепт более точной визуализации t-SNE основан на трех идеях, которые ранее были предложены в различных контекстах: многомасштабное сходство ^13,14 , инициализация PCA и повышенная скорость обучения ¹⁵ .

На рис. 1c используется недоумение 30, которое является значением по умолчанию в большинстве реализаций t-SNE. Гораздо большие значения могут привести к качественно другим результатам. Поскольку большое недоумение дает более дальнодействующие силы притяжения во время оптимизации t-SNE, визуализация теряет некоторые мелкие детали, но объединяет более крупные структуры.В качестве простого эмпирического правила мы принимаем 1% размера выборки как большое недоумение для любого заданного набора данных; это соответствует недоумению 155 для наших смоделированных данных и приводит к тому, что пять небольших кластеров, принадлежащих к одному классу, стягиваются вместе (рис. 1d). Наши метрики подтвердили, что по сравнению со стандартным значением сложности локальная структура (KNN) ухудшается, но глобальная структура (KNC и CPD) улучшается. Ранее был предложен мультимасштабный подход с одновременным использованием нескольких значений недоумения для сохранения как локальной, так и глобальной структуры ^13,14 .Мы применяем этот подход в нашем финальном конвейере и всякий раз, когда \(n/100\gg 30\), комбинируем недоумение 30 с большим недоумением \(n/100\) (см. ниже; отдельная оценка здесь не показана).

Другой подход к сохранению глобальной структуры заключается в использовании информативной инициализации, например. первые два ПК (после соответствующего масштабирования, см. Методы). Это вводит глобальную структуру во вложение t-SNE, которое затем сохраняется в ходе оптимизации t-SNE, в то время как алгоритм оптимизирует тонкую структуру (рис.1д). Действительно, KNN не зависел от инициализации, но и KNC, и CPD заметно улучшились при использовании инициализации PCA. Инициализация PCA также удобна, потому что она делает результат t-SNE воспроизводимым и не зависящим от случайного начального числа.

Третьим компонентом нашего протокола t-SNE является увеличение скорости обучения. Скорость обучения по умолчанию в большинстве реализаций t-SNE составляет \(\eta=200\), чего недостаточно для больших наборов данных и может привести к плохой сходимости и/или сходимости к субоптимальному локальному минимуму ¹⁵ .Недавняя библиотека Python для анализа scRNA-seq, scanpy, увеличила скорость обучения по умолчанию до 1000 ²³ , тогда как ref. ¹⁵ предложил использовать \(\eta =n/12\). Мы принимаем последнее предложение и используем \(\eta =n/12\) всякий раз, когда оно превышает 200. Это не оказывает большого влияния на наш синтетический набор данных (поскольку размер его выборки недостаточно велик, чтобы это имело значение), но будет важно позже.

Соединяя все три модификации вместе, получаем визуализацию, показанную на рис.1ф. Количественная оценка подтвердила, что с точки зрения мезоскопической/макроскопической структуры предложенный нами конвейер значительно превзошел стандартный t-SNE и был лучше, чем большое недоумение или инициализация PCA сами по себе. В то же время с точки зрения микроскопической структуры удалось достичь компромисса между малыми и большими затруднениями.

Достоверный t-SNE наборов транскриптомных данных

Чтобы продемонстрировать эти идеи на реальном наборе данных, мы решили сосредоточиться на наборе данных от Tasic et al. ³ . Он включает 23 822 клетки коры головного мозга взрослых мышей, разделенных авторами на 133 кластера с строгой иерархической организацией. Здесь и далее мы использовали стандартный конвейер предварительной обработки, состоящий из нормализации глубины секвенирования, выбора признаков, логарифмического преобразования и уменьшения размерности до 50 ПК (см. Методы).

В Tasic et al. данных, на графиках MDS (рис. 2а) и PCA (рис. 2b) видны три четко разделенные группы кластеров, соответствующие возбуждающим нейронам (холодные цвета), тормозным нейронам (теплые цвета) и ненервным клеткам, таким как как астроциты или микроглия (серые/коричневые цвета).Выполнение PCA для этих трех подмножеств данных по отдельности (дополнительный рисунок 1) раскрывает дополнительную структуру внутри каждого из них: например. тормозные нейроны хорошо разделены на две группы: экспрессирующие Pvalb/SSt (красный/желтый) и экспрессирующие Vip/Lamp5 (фиолетовый/лососевый), как также видно на рис. 2а. Это демонстрирует иерархическую организацию данных.

Рис. 2

Tasic et al. набор данных. Объем выборки \(n=23,\!822\). Назначения кластеров и цвета кластеров взяты из оригинальной публикации ³ .Теплые цвета соответствуют тормозным нейронам, холодные цвета соответствуют возбуждающим нейронам, коричневые/серые цвета соответствуют ненервным клеткам. и MDS по классу означает (\(n=133\)). Размер баллов пропорционален количеству баллов в классе. b Первые два главных компонента данных. KNN: сохранение 10 ближайших соседей, KNC: сохранение 10 ближайших классов, CPD: корреляция Спирмена между парными расстояниями. c t-SNE по умолчанию с недоумением 30, случайной инициализацией и скоростью обучения 200. d Т-СНЭ с недоумением \(n/100=238\). Метки обозначают большие группы кластеров. e T-SNE с инициализацией PCA. f T-SNE с многоуровневыми сходствами (сложная комбинация 30 и \(n/100=238\), инициализация PCA и скорость обучения \(n/12 \приблизительно 2000\).

Эта глобальная структура отсутствуют в стандартной визуализации t-SNE (рис. 2c): возбуждающие нейроны, тормозные нейроны и не-нейронные клетки разделены на несколько островков, которые перемешаны друг с другом.Например, группа пурпурных кластеров ( Vip интернейронов) отделена от группы лососевых кластеров (близкородственная группа интернейронов Lamp5 ) некоторыми возбуждающими кластерами, что искажает иерархию типов клеток. Этот результат не является ложным: в исходной статье ³ фигура t-SNE качественно очень похожа на нашу визуализацию. Значения недоумения в обычном диапазоне (например, 20, 50, 80) дают аналогичные результаты, подтверждая, что t-SNE не очень чувствителен к точному значению недоумения.

Напротив, установка недоумения на 1% размера выборки, в данном случае на 238, сближает большие группы связанных типов, улучшая глобальную структуру (увеличение KNC и CPD) за счет потери части тонкой структуры (KNN уменьшается, рис. 2г). Инициализация PCA с недоумением по умолчанию также улучшает глобальную структуру (увеличение KNC и CPD по сравнению с t-SNE по умолчанию, рис. 2e). Наконец, предложенный нами конвейер с многоуровневыми сходствами (сложная комбинация 30 и \(n/100=238\)), инициализацией PCA и скоростью обучения \(n/12 \приблизительно 2000\) дает вложение с высокими значениями все три показателя (рис.2е). По сравнению с параметрами по умолчанию эти настройки замедлили FIt-SNE с \(\sim\)30 с до \(\sim\)2 м, что мы по-прежнему считаем приемлемым временем выполнения.

Полезно систематически изучать, как выбор параметров влияет на качество встраивания (рис. 3). Мы обнаружили, что скорость обучения влияет только на KNN: чем выше скорость обучения, тем лучше сохраняется локальная структура, пока она не насыщается на уровне около \(n/10\) (рис. 3а), что согласуется с результатами исх. ¹⁵ . На два других показателя, KNC и CPD, скорость обучения не влияет (рис. 3c, e). Перплексия определяет компромисс между KNN и KNC: чем выше перплексность в сочетании с 30, тем хуже микроскопическая структура (рис. 3b), но тем лучше мезоскопическая структура (рис. 3d). Наш выбор \(n/100\) обеспечивает разумный компромисс. Наконец, инициализация PCA значительно улучшает макроскопическую структуру, измеренную с помощью CPD (рис. 3e, f), в то время как два других параметра мало на нее влияют.

Рис. 3

Влияние значений параметров на качество встраивания. На всех панелях показаны оценки качества различных вложений t-SNE исследования Tasic et al. набор данных. a Сохранение 10 ближайших соседей (KNN) в зависимости от скорости обучения. Черная линия показывает инициализацию PCA, серые линии показывают случайную инициализацию с тремя разными случайными начальными значениями. Большая черная точка обозначает наши предпочтительные значения параметров. Недоумение сочетание 30 и \(n/100\). b 10-сохранение ближайших соседей как функция недоумения, используемого в сочетании с недоумением 30.Скорость обучения \(n/12\). c – d То же для сохранения 10 ближайших классов (KNC). e – f То же для корреляции Спирмена между парными расстояниями (CPD).

Чтобы продемонстрировать, что наш подход одинаково хорошо применим к транскриптомным данным на основе UMI, мы рассмотрели еще три набора данных. Во-первых, мы проанализировали n  = 44808 данных о сетчатке мыши из ссылки. ²⁴ . Наш результат t-SNE сохранил большую часть глобальной геометрии (рис.4а): например. множественные скопления амакриновых клеток (зеленые), скопления биполярных клеток (синие) и скопления ненейронных клеток (пурпурные) располагались близко друг к другу. Анализ t-SNE, выполненный авторами в оригинальной публикации, основывался на субдискретизации и имел худшее представление иерархии кластеров.

Рис. 4

Наборы данных на основе UMI. Назначения кластеров и цвета кластеров взяты из оригинальных публикаций. a Macosko et al. ²⁴ , n = 44 808 клеток сетчатки мыши.Биполярные клетки составляют восемь кластеров, амакриновые клетки — 21 кластер. Ненейральные кластеры обозначаются аббревиатурой (MG Mueller glia, A астроциты, F фибробласты, P перициты, E эндотелий, M микроглия). б Шекхар и др. ²⁵ , n  = 27 499 клеток сетчатки мыши, в основном биполярные клетки. Биполярная ячейка BC, биполярная ячейка RBC. Предполагаемые дублеты/примеси показаны серым цветом. Желтый: палочки и колбочки фоторецепторы; голубой: амакриновые клетки. Некоторые кластеры кажутся состоящими из двух частей; это связано с эффектом экспериментальной партии, который мы не убрали. c Harris et al. ²⁶ , n  = 3663 интернейрона гиппокампа. Круги обозначают центроиды кластера. Центроид одного кластера ( Sst Cryab ) не показан, так как его ячейки были разбросаны по всей вставке (как и в исходной публикации). Метки кластеров не показаны для наглядности.

Во-вторых, мы проанализировали набор данных n  = 27 499 из ссылки. ²⁵ , который секвенировал клетки сетчатки мыши, нацеленные на биполярные нейроны.Здесь снова наш результат t-SNE (рис. 4b) согласуется с глобальной структурой данных: например, биполярные клетки ВЫКЛ (типы 1–4, теплые цвета) и ВКЛ биполярные клетки (типы 5–9, холодные цвета). ) расположены близко друг к другу, и четыре подтипа типа 5 также близко друг к другу. Это было не так для t-SNE, показанного в оригинальной публикации. Этот набор данных показывает одно ограничение нашего метода: данные содержат несколько очень разных, но очень редких кластеров, и они появляются в середине вложения, а не расположены далеко на периферии (см. Обсуждение).

Наконец, мы проанализировали \(n=3663\) набор данных интернейронов гиппокампа из ref. ²⁶ . В исходной публикации был представлен новый метод кластеризации и выбора признаков, основанный на отрицательном биномиальном распределении, и использовалась модифицированная отрицательная биномиальная процедура t-SNE. Наша визуализация t-SNE (рис. 4c) ничего из этого не использовала, но, тем не менее, привела к встраиванию, очень похожему на то, что показано в исходной статье. Обратите внимание, что для наборов данных такого размера наш метод использует недоумение и скорость обучения, близкие к значениям по умолчанию.

Позиционирование новых точек в существующем атласе t-SNE

Обычной задачей в транскриптомике одиночных клеток является сопоставление данной клетки с существующим эталонным набором данных. Например, введение протокола под названием Patch-seq, исх. ²⁷ выполнили электрофизиологические записи патч-кламп с последующим секвенированием РНК тормозных клеток в слое 1 зрительной коры мыши. Учитывая существование гораздо большего Tasic et al. набора данных, описанного выше, естественно спросить, где на рис.2f, взятом в качестве эталонного атласа, следует расположить эти ячейки Patch-seq.

Часто утверждается, что t-SNE не допускает картографирования вне выборки, т. е. никакие новые точки не могут быть добавлены в атлас t-SNE после его построения. Это означает, что t-SNE является непараметрическим методом, который не строит никаких отображений \({\mathrm{f}}({\boldsymbol{x}})\) из пространства высокой размерности в пространство низкой размерности ( параметрический t-SNE возможен, но выходит за рамки этой статьи, см. Обсуждение). Тем не менее, есть простой способ разместить новый \({\boldsymbol{x}}\) в существующем атласе t-SNE.Для каждого Cadwell et al. ячейке (\(n=46\)), мы нашли ее \(k=10\) ближайших соседей среди клеток Tasic et al. эталонные клетки с использованием корреляции Пирсона по логарифмически преобразованным подсчетам наиболее изменчивых Tasic et al. гены как расстояние ²⁸ . Затем мы разместили ячейку в срединном месте t-SNE этих \(k\) эталонных клеток (рис. 5а). Результат очень хорошо согласуется с заданием Cadwell et al. клетки к Tasic et al. кластеры, выполненные в исх. ³ .

Рис.5

Картирование вне выборки. и Интернейроны из арт. ²⁷ расположен на эталонном атласе t-SNE ³ с рис. 2f. Здесь показан только континент Vip/Lamp5 с рис. 2f, так как ни одна клетка не нанесена на карту где-либо еще. Метки кластера даются только для кластеров, которым сопоставлена ​​хотя бы одна ячейка. нейроглиаформные клетки NGC; Одиночный букет клеток SBC. Две ячейки из 46 не показаны, потому что у них было неоднозначное назначение класса. b Метод перекрестной проверки: 100 случайных клеток Vip/Lamp5 из Tasic et al.набор данных был удален из встраивания t-SNE, а затем снова помещен в него с использованием нашего метода. Черные точки показывают новые позиции, черные линии соединяют их с исходными местоположениями t-SNE тех же клеток. c Неопределенность позиционирования для нескольких примерных ячеек из панели a . Многоугольники — это выпуклые оболочки, покрывающие 95% бутстраповских повторений.

Важным предостережением является то, что этот метод предполагает, что для каждой новой ячейки в наборе эталонных данных есть ячейки того же типа.Ячейки, которые не имеют хорошего совпадения в эталонных данных, могут в конечном итоге оказаться в заблуждении. Однако это предположение оправдано всякий раз, когда клетки сопоставляются с всеобъемлющим эталонным атласом, охватывающим ту же ткань, как в примере, показанном здесь.

В более сложном подходе ^24,29,30 каждая новая ячейка изначально позиционируется, как описано выше, но затем ее положение оптимизируется с использованием функции потерь t-SNE: ячейка притягивается к своим ближайшим соседям в эталонном наборе. , с эффективным числом ближайших соседей, определяемым недоумением.Мы обнаружили, что более простая процедура без этого дополнительного шага оптимизации хорошо работала для наших данных; дополнительная оптимизация обычно имеет лишь незначительный эффект ³⁰ .

Мы можем продемонстрировать непротиворечивость нашего метода с помощью процедуры, аналогичной перекрестной проверке с исключением одного. Мы неоднократно удаляли одну случайную группу Tasic et al. ячейку из кластеров Vip/Lamp5 и поместил ее обратно в тот же эталонный атлас t-SNE (исключая ту же ячейку из \(k=10\) ближайших соседей).В 100 повторениях среднее расстояние между исходным положением ячейки и тестовым положением было \(3,2\pm 2,4\) (среднее\(\pm\)SD; см. рис. 5b для масштабной линейки), и большинство тестовых клеток остались внутри их кластеров.

Неопределенность позиционирования можно оценить с помощью бутстрэппинга между генами (вдохновлено ссылкой ³ ). Для каждой из клеток Patch-seq мы неоднократно отбирали бутстреп-образец из набора высоковариабельных генов и повторяли процедуру позиционирования (100 раз).Это дало набор загрузочных местоположений отображения; чем больше изменчивость в этом наборе, тем больше неопределенность. Чтобы визуализировать неопределенность, мы показываем выпуклую оболочку, покрывающую 95% повторений начальной загрузки (рис. 5c), которую можно интерпретировать как двумерный доверительный интервал. Большой полигон означает высокую неопределенность; маленький полигон означает высокую точность. Для некоторых ячеек полигоны настолько малы, что едва видны на рис. 5в. Для некоторых других ячеек полигоны больше и иногда выходят за границу двух соседних кластеров.Это говорит о том, что кластерные назначения для этих ячеек не являются определенными.

Совмещение двух визуализаций t-SNE

Tasic et al. ³ является продолжением Tasic et al. ³¹ , где \(n=1679\) клеток зрительной коры мыши секвенировали с помощью более раннего протокола секвенирования. Если исключить из нового набора данных все кластеры, в которых клетки в основном находятся за пределами зрительной коры, то в оставшемся наборе данных будет \(n=19,\!366\) ячеек. Насколько похожа кластерная структура этого более нового и крупного набора данных по сравнению со старым и меньшим? Один из способов подойти к этому вопросу — с помощью выровненных визуализаций t-SNE.

Чтобы получить выровненные визуализации t-SNE, мы сначала выполнили t-SNE более старого набора данных ³¹ , используя инициализацию PCA и недоумение 50 (рис. 6a). Затем мы расположили ячейки более нового набора данных ³ по этой ссылке, используя процедуру, описанную выше, и использовали полученный макет в качестве инициализации для t-SNE (со скоростью обучения \(n/12\) и комбинацией недоумения 30 и \( п/100\), как и везде). Полученное встраивание t-SNE выравнивается с предыдущим (рис.6б).

Рис. 6

Выровненные вставки. a T-SNE визуализация набора данных из ссылки. ³¹ . Назначения кластеров и цвета кластеров взяты из оригинальной публикации. Кружками показаны центроиды кластеров. Цифрами отмечены некоторые заслуживающие внимания случаи, см. текст. b T-SNE визуализация набора данных из исх. ³ после исключения всех кластеров, которые в основном состояли из клеток передней латеральной моторной коры (23 кластера, в названии которых было слово «ALM»).Этот анализ t-SNE был инициализирован путем размещения всех клеток на эталонном атласе из панели a , гарантируя, что две панели выровнены друг с другом.

Несколько наблюдений выделены на рис. 6. (1) и (2) являются примерами хорошо изолированных скоплений в данных 2016 г., которые остались хорошо изолированными в данных 2018 г. ( Sst Chodl и Pvalb Vipr2 ; здесь и ниже мы используем номенклатуру 2018 года). (3) — пример небольшой группы клеток, которая не была выделена в отдельный кластер еще в 2016 г., стала отдельной на основании данных 2018 г., но в ретроспективе выглядит хорошо обособленной уже на графике t-SNE 2016 г. ( два кластера L5 LP VISp Trhr ).Наконец, (4) показывает пример объединения нескольких кластеров данных за 2016 год в один кластер на основе данных за 2018 год ( L4 IT VISp Rspo1 ). Эти наблюдения находятся в хорошем соответствии с выводами работы. ³ , но мы обнаружили, что t-SNE добавляет ценную перспективу и позволяет проводить интуитивное сравнение.

Выполнение t-SNE на больших наборах данных

Большие наборы данных с \(n\gg 100 000\) создают несколько дополнительных проблем по сравнению с теми, которые уже обсуждались выше.Во-первых, ванильное t-SNE ⁹ медленно для \(n\gg 1000\) и вычислительно невыполнимо для \(n\gg 10,\!000\) (см. Методы). Широко используемое приближение под названием Barnes-Hut t-SNE ³² , в свою очередь, становится очень медленным для \(n\gg 100,\!000\). Для больших наборов данных требуется более быстрая схема аппроксимации. Эта задача была эффективно решена исх. ¹⁶ , который разработал новое приближение t-SNE, названное FIt-SNE, основанное на схеме интерполяции, ускоренной быстрым преобразованием Фурье.Используя FIt-SNE, мы смогли обработать набор данных с 1 миллионом точек и 50 размерностями (perplexity 30) за 29 мин на компьютере с четырьмя двухпоточными ядрами 3,4 ГГц и за 11 мин на сервере с двадцатью 2,2 ГГц. двухзаходные сердечники.

Во-вторых, для \(n\gg 100,\!000\) t-SNE с параметрами оптимизации по умолчанию имеет тенденцию давать плохо сходящиеся решения и вложения с непрерывными кластерами, фрагментированными на несколько частей. Различные группы ^16,23 заметили, что эти проблемы можно решить, увеличив количество итераций, длину или силу раннего преувеличения (см. Методы) или скорость обучения.Ссылка ¹⁵ продемонстрировал в тщательном исследовании, что резкое увеличение скорости обучения со значения по умолчанию \(\eta =200\) до \(\eta =n/12\) (где 12 — коэффициент раннего преувеличения ³³ ) предотвращает фрагментация кластера на ранней стадии преувеличения и дает хорошо сходящееся решение в пределах 1000 итераций по умолчанию.

В-третьих, для \(n\gg 100,\!000\) вложения t-SNE становятся очень тесными, с небольшим пробелом даже между хорошо разделенными кластерами ¹⁸ .Точная математическая причина этого до конца не понятна, но интуитивно понятно, что недоумение по умолчанию становится слишком маленьким по сравнению с размером выборки, силы отталкивания начинают доминировать, а кластеры взрываются и сливаются, как соседние мыльные пузыри. Хотя до сих пор нет принципиального решения для этого в структуре t-SNE, очень практичный трюк, предложенный исх. ³⁴ заключается в увеличении силы всех сил притяжения с помощью небольшого постоянного коэффициента преувеличения между 1 и \(\sim\)10 (см. Методы).Это противодействует расширению кластеров.

В-четвертых, наш подход к сохранению глобальной геометрии основан на использовании большой степени недоумения \(n/100\) и становится невыполнимым с вычислительной точки зрения при \(n\gg 100,\!000\), поскольку время выполнения FIt-SNE растет линейно с ростом сложности. Для таких размеров выборки единственной практической возможностью является использование значений сложности в стандартном диапазоне 10–100. Чтобы решить эту проблему, мы делаем предположение, что глобальная геометрия должна обнаруживаться даже после сильного понижения дискретизации набора данных.Это предполагает следующий конвейер: (i) уменьшить выборку большого набора данных до некоторого управляемого размера; (ii) запустить t-SNE на подвыборке, используя наш подход для сохранения глобальной геометрии; (iii) разместить все оставшиеся точки на результирующем графике t-SNE, используя ближайших соседей; (iv) использовать результат в качестве инициализации для запуска t-SNE на всем наборе данных.

Мы демонстрируем эти идеи, используя два крупнейших в настоящее время набора данных scRNA-seq. Первый представляет собой набор данных 10x Genomics с \(n=1,\!306,\!127\) клетками эмбрионального мозга мыши.Сначала мы создали вложение t-SNE случайно выбранного подмножества ячеек \(n=25,\!000\) (рис. 7a). Как и выше, мы использовали инициализацию PCA, комбинацию недоумения 30 и \(n/100=250\) и скорость обучения \(n/12\). Затем мы разместили все оставшиеся ячейки в этом вложении t-SNE, используя их ближайших соседей (здесь мы использовали евклидово расстояние в пространстве PCA и \(k=10\), как указано выше; это заняло \(\sim\)10  мин) . Наконец, мы использовали результат в качестве инициализации для запуска t-SNE во всех точках, используя недоумение 30, коэффициент преувеличения 4 и скорость обучения \(n/12\) (рис.7б).

Рис. 7

10x Набор данных Genomics. Объем выборки \(n=1,\!306,\!127\). Назначения кластеров и цвета кластеров взяты из ссылки. ²³ . T-SNE случайной подвыборки из \(25,\!000\) ячеек (инициализация PCA, комбинация недоумения 30 и 250, скорость обучения \(25,\!000/12\)). Метки кластеров для нескольких небольших кластеров (30, 35, 36 и 38) здесь и в b не показаны, поскольку эти кластеры были сильно разбросаны по вложениям. b T-SNE полного набора данных.Все ячейки были размещены на закладке в панели и , и это использовалось в качестве инициализации. Недоумение 30, преувеличение 4, скорость обучения \(n/12\). c То же, что и в b , но без преувеличения. d То же, что и в b , но с инициализацией PCA, т.е. без использования шага даундискретизации. e t-SNE по умолчанию со скоростью обучения, установленной на \(\eta =1000\): случайная инициализация, без преувеличения.

Чтобы подтвердить эту процедуру, мы идентифицировали значимые биологические структуры во встраивании с использованием маркерных генов развития ^35,36,37 .Левая часть основного континента состоит из радиальных глиальных клеток, экспрессирующих Aldoc и Slc1a3 (рис. 8а). Соседние области состоят из нейральных предшественников (нейробластов), экспрессирующих Eomes , ранее известных как Tbr2 (рис. 8b). Правая часть основного континента состоит из зрелых возбуждающих нейронов, экспрессирующих паннейрональные маркеры, такие как Stmn2 и Tubb3 (рис. 8c), но не экспрессирующих тормозные маркеры нейронов Gad1 или Gad2 (рис.8г), тогда как верхнюю часть закладки занимают несколько кластеров тормозных нейронов (рис. 8г). Это подтверждает, что наше встраивание t-SNE демонстрирует значимую топологию и способно фиксировать траектории развития: от радиальной глии к возбуждающим/тормозным нейронным предшественникам и к возбуждающим/тормозным зрелым нейронам.

Рис. 8

Маркерные гены развития. Наложение на встраивания t-SNE с рис. 7. a Экспрессия гена Aldoc (маркер радиальной глии) на встраивание t-SNE с рис.7б. Любая ячейка с обнаруженным Aldoc (счетчик UMI выше нуля) окрашивалась в красный цвет. Другой маркер радиальной глии, Slc1a3 , имел сходную, но немного более широкую экспрессию. b Экспрессия Eomes , маркера нейральных предшественников (нейробластов). c Экспрессия Stmn2 , маркера зрелых нейронов. Паннейронный маркер Tubb3 имел сходную, но несколько более широкую экспрессию. d Экспрессия Gad1 и Gad2 (любого из них), маркеров тормозных нейронов. e – h Те же гены накладываются на стандартное встраивание t-SNE на рис. 7e.

Мы иллюстрируем важность компонентов нашего конвейера серией контрольных экспериментов. Без преувеличения были получены чрезмерно расширенные кластеры и менее различимая глобальная структура (рис. 7c). Без субдискретизации глобальная геометрия сохранилась хуже (рис. 7г): например. большинство кластеров интернейронов находится в нижней части рисунка, а кластеры 17 и 19 (развивающиеся интернейроны) расположены в верхней части.Наконец, t-SNE по умолчанию со случайной инициализацией и без преувеличения (но скорость обучения, установленная на \(\eta =1000\)) дала плохое вложение, которое фрагментировало некоторые кластеры и искажало глобальную геометрию (рис. 7e). Действительно, наложение одних и тех же маркерных генов показало, что траектории развития не сохранились и родственные группы клеток, т.е. интернейроны были рассредоточены по встраиванию (рис. 8e–h). Опять же, это не чучело: это вложение качественно похоже на приведенные в литературе ^23,38 .

Кроме того, мы проанализировали набор данных, включающий \(n=2,\!058,652\) клеток эмбриона мыши на нескольких стадиях развития ⁸ . В исходной публикации показано вложение t-SNE, которое мы воспроизвели на рис. 9a. Несмотря на то, что он демонстрировал большую структуру, он явно страдал от всех проблем, упомянутых выше: некоторые кластеры были фрагментированы на части (например, кластеры 13 и 15), было мало разделения между отдельными типами клеток, а глобальная структура была сильно искажена.Авторы аннотировали все кластеры и разделили их на десять биологически значимых траекторий развития; эти траектории перемешались в их вложении. Напротив, наше встраивание t-SNE (рис. 9b) аккуратно разделило все десять траекторий развития и упорядочило кластеры внутри основных траекторий в значимом порядке развития: например. наблюдалась непрерывная прогрессия от радиальной глии (кластер 7) к нейральным предшественникам (9), к постмитотическим преждевременным нейронам (10), к зрелым возбуждающим (5) и тормозным (15) нейронам.

Рис. 9

Cao et al. набор данных. Объем выборки \(n=2,\!058,\!652\). Назначения кластеров и цвета кластеров взяты из оригинальной публикации ⁸ . встраивание T-SNE из оригинальной публикации. Авторы запустили t-SNE в режиме scanpy с настройками по умолчанию, то есть со случайной инициализацией, недоумением 30 и скоростью обучения 1000. Аннотации кластеров см. в оригинальной публикации. b Встраивание T-SNE, созданное с помощью нашего конвейера для больших наборов данных: случайная выборка из \(25,\!000\) ячеек была встроена с использованием инициализации PCA, скорость обучения \(25,\!000/12\), и недоумение сочетание 30 и 250; все остальные ячейки были размещены на полученном встраивании, и это использовалось для инициализации t-SNE со скоростью обучения \(2,\!058,\!652/12\), недоумением 30 и преувеличением 4.Метки соответствуют десяти траекториям развития, указанным в оригинальной публикации. Метки заглавными буквами обозначают траектории, состоящие из нескольких кластеров. 32 011 предполагаемых дублетных клеток не показаны ни на одной из панелей.

Сравнение с UMAP

Многообещающий метод уменьшения размерности под названием UMAP ¹⁰ недавно привлек значительное внимание сообщества транскриптомиков ¹¹ . Технически UMAP очень похож на более ранний метод под названием largeVis ³⁹ , но ref. ¹⁰ предоставил математическую основу и удобную реализацию Python. LargeVis и UMAP используют те же силы притяжения, что и t-SNE, но изменяют характер сил отталкивания и используют другой подход к оптимизации, основанный на выборке. Утверждается, что UMAP быстрее, чем t-SNE, и превосходит его с точки зрения сохранения глобальной структуры данных ^10,11 .

Хотя UMAP действительно намного быстрее, чем Barnes-Hut t-SNE, FIt-SNE ¹⁶ по крайней мере так же быстр, как UMAP.Мы обнаружили, что FIt-SNE 1.1 с настройками по умолчанию в \(\sim\)4 раза быстрее, чем UMAP 0.3 с настройками по умолчанию, при анализе геномики 10x (14 м против 56 м) и Cao et al. (31 м против 126 м) наборов данных на сервере с двадцатью двухпоточными ядрами 2,2 ГГц (для этого эксперимента входная размерность была 50, а выходная размерность — 2; UMAP может быть более конкурентоспособным при других настройках). Тем не менее, точное время выполнения будет зависеть от деталей реализации, и оба метода могут быть дополнительно ускорены в будущих выпусках или с использованием распараллеливания графического процессора ⁴⁰ .

Чтобы сравнить UMAP с нашим подходом t-SNE с точки зрения сохранения глобальной структуры, мы сначала запустили UMAP на синтетическом и Tasic et al. ³ наборов данных (дополнительный рисунок 2). Мы использовали параметры UMAP по умолчанию, а также изменили два ключевых параметра (количество соседей и плотность встраивания), чтобы получить вложение, более похожее на t-SNE. В обоих случаях и для обоих наборов данных все три показателя (KNN, KNC и CPD) были значительно ниже, чем при нашем подходе t-SNE.Примечательно, что мы заметили, что в некоторых случаях глобальная структура вложений UMAP сильно зависит от случайного начального числа. Затем мы применили UMAP с параметрами по умолчанию к 10x Genomics и Cao et al. наборы данных. Здесь вложения UMAP были качественно похожи на наши вложения t-SNE, но, возможно, искажали некоторые аспекты глобальной топологии (дополнительный рисунок 3).

Углубленное сравнение t-SNE и UMAP выходит за рамки нашей статьи, но этот анализ предполагает, что предыдущие заявления о том, что UMAP значительно превосходит t-SNE ¹¹ , могли быть частично связаны с применением t-SNE в неоптимальный способ.Наш анализ также показывает, что UMAP не обязательно решает проблемы t-SNE «из коробки» и может потребовать такого же тщательного выбора параметров и/или инициализации, как это делает t-SNE. Многие рекомендации по запуску t-SNE, которые мы сделали в этой рукописи, вероятно, могут быть адаптированы для UMAP.